Brug af multilayered Hydrogel Bioink i tredimensionel bioprint til homogen cellefordeling
Summary
Her udviklede vi en ny flerlaget modificeret strategi for væskelignende bioinks (gelatin methacryloyl med lav viskositet) for at forhindre sedimentering af indkapslede celler.
Abstract
Under ekstrudering-baserede tre-dimensionelle bioprint proces, væske-lignende bioinks med lav viskositet kan beskytte celler mod membran skader induceret af forskydning stress og forbedre overlevelsen af indkapslede celler. Hurtig tyngdekraftsdrevet cellesedimentering i reservoiret kan imidlertid føre til en inhomogen cellefordeling i biotrykte strukturer og dermed hindre anvendelsen af væskelignende bioinks. Her udviklede vi en ny flerlaget modificeret strategi for væskelignende bioinks (f.eks. gelatine methacryloyl med lav viskositet) for at forhindre sedimentering af indkapslede celler. Flere flydende grænseflader blev manipuleret i den flerlagede bioink for at give interfacial retention. Derfor blev cellesedimenteringsaktionen på tværs af tilstødende lag i flerlaget systemet forsinket i bioinkbeholderen. Det blev konstateret, at den interfaciale retention var meget højere end sedimental træk af celler, hvilket viser en kritisk rolle af den interfaciale fastholdelse i forebyggelsen af celle sedimentering og fremme en mere homogen spredning af celler i flerlaget bioink.
Introduction
Tredimensional (3D) biotryk har været en lovende metode til fremstilling af komplekse arkitektoniske og funktionelle replikaer af indfødte væv i biofabrikation og regenerativ medicin1,2,3. De fælles strategier for bioprint, herunder inkjet, ekstrudering, og stereolitografi udskrivning, har fordele og ulemper fra forskellige perspektiver4. Blandt disse teknikker, ekstrudering procedure er mest almindeligt anvendt på grund af dens omkostningseffektivitet. Bioink spiller en central rolle i processen stabilitet ekstrudering bioprinting. Den ideelle cellefyldte bioink bør ikke kun være biokompatibel, men også være egnet til mekaniske egenskaber5. Bioinks med lav viskositet præsenteres typisk som en væskelignende tilstand. Disse bioinks kan nemt og hurtigt deponeres og undgå cellemembranskader forårsaget af høj forskydningsstress under ekstrudering. I komplekse tilfælde, der kræver længere tids trykningsperioder, giver lav viskositet imidlertid ofte anledning til den uundgåelige sedimentering af de indkapslede celler i bioinkbeholderen, som normalt er drevet af tyngdekraften og fører til en uhomogen cellespredning i bioink6,7. Derfor hæmmer en bioink med inhomogen cellespredning in vitro bioprinting af en funktionel vævskonstruktion.
Flere nylige undersøgelser med fokus på bioinks har rapporteret fremme af homogen spredning af indkapslede celler. En modificeret alginat bioink baseret på dual-stage crosslinking blev brugt til ekstrudering bioprint8. En alginat polymer blev modificeret med peptider og proteiner i denne undersøgelse. Cellerne præsenterede en mere homogen fordeling i denne modificerede alginat end i det almindeligt anvendte alginat på grund af de fastgørelsessteder, som peptiderne og proteinerne giver. Alternativt er blandede bioinks blevet udnyttet til at løse sedimentering af celler i bioink. I en anden undersøgelse9blev der anvendt en blandet bioink indeholdende polyethylenglycol (PEG) og gelatine eller gelatine methacryloyl (GelMA) med forbedret mekanisk robusthed. De indkapslede celler præsenterede en homogen fordeling, hovedsagelig fordi viskositeten af den blandede bioink blev forbedret. Generelt er der flere faktorer, der påvirker spredningen af de indkapslede celler i bioink, såsom bioinks viskositet, cellernes tyngdekraft, cellernes tæthed og arbejdsperiodens varighed. Blandt disse faktorer spiller cellernes tyngdekraft en afgørende rolle i at fremme sedimentering. Opdrift og friktion fra den viskose bioink er blevet undersøgt som de vigtigste kræfter mod tyngdekraften til dato10.
Heri udviklede vi en ny strategi for at fremme homogen spredning af de indkapslede celler i bioink ved at manipulere flere flydende grænseflader i bioinkreservoiret. Disse flydende grænseflader skabt af den flerlagede ændring af bioink kan ikke kun give interfacial fastholdelse, som forsinker sedimentering af celler, men også opretholde en passende biokompatibilitet og reologisk adfærd bioink. I praksis ændrede vi den vandige GelMA-opløsning (5%, w/v) med silkefibrosin (SF) på en flerlaget måde til langsgående at producere fire grænseflader, hvilket giver interfacial spændinger i den blandede bioink. Som følge heraf blev tyngdekraftbelastningen på cellerne opvejet af den menneskeskabte interfacial spænding, og en næsten homogen spredning af de indkapslede celler i bioink blev opnået på grund af mindre sedimentering på tværs af de tilstødende lag af celler. Der er til dato ikke rapporteret nogen lignende protokol til at bremse sedimentering af indkapslede celler ved at manipulere interfacial retention i flydende bioinks er blevet rapporteret til dato. Vi præsenterer vores protokol her for at demonstrere en ny måde at løse celle sedimentering i bioprint.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stabiliteten af det flerlagede system er et centralt punkt for at udføre denne protokol med succes. Vi beregnede teoretisk diffusionen af SF-molekyler i GelMA-opløsningen baseret på Naumans studie13. Det blev konstateret, at udbredelsen af proteiner i opløsning var relateret til deres molekylvægt. Den gennemsnitlige molekylvægt (MW) for bovin serumalbumin (BSA) er 66,5 kDa, og dens diffusionskoefficient er 64-72 μm2/s. Den gennemsnitlige MW fibrinogen er 339,7 kDa, og dens diffus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 og 81570422), Kinas nationale nøgleprogram (2018YFC1005002), Shanghai Kommunes videnskabs- og teknologikommission (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) og Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-0 7-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
