Bruke flerlags hydrogel bioink i tredimensjonal biotrykking for homogen cellefordeling
Summary
Her utviklet vi en ny flerlags modifisert strategi for væskelignende bioinks (gelatin metakryloyl med lav viskositet) for å forhindre sedimentering av innkapslede celler.
Abstract
Under ekstruderingsbasert tredimensjonal bioprintingprosess kan væskelignende bioinks med lav viskositet beskytte celler mot membranskader forårsaket av skjærstress og forbedre overlevelsen av de innkapslede cellene. Imidlertid kan rask gravitasjonsdrevet cellesedimentering i reservoaret føre til en inhomogen cellefordeling i biotrykte strukturer og dermed hindre bruk av væskelignende bioinks. Her utviklet vi en ny flerlags modifisert strategi for væskelignende bioinks (f.eks gelatin methacryloyl med lav viskositet) for å forhindre sedimentering av innkapslede celler. Flere flytende grensesnitt ble manipulert i flerlags bioink for å gi interfacial oppbevaring. Følgelig ble cellesedimenteringshandlingen som gikk over tilstøtende lag i flerlagssystemet, tilbakestående i bioinkreservoaret. Det ble funnet at interfacial oppbevaring var mye høyere enn sedimental trekk av celler, viser en kritisk rolle av interfacial oppbevaring i å hindre celle sedimentering og fremme en mer homogen spredning av celler i flerlags bioink.
Introduction
Tredimensjonal (3D) bioprinting har vært en lovende metode for å produsere komplekse arkitektoniske og funksjonelle kopier av innfødte vev i biofabrikasjon og regenerativ medisin1,,2,3. De vanlige strategiene for bioprinting, inkludert inkjet, ekstrudering og stereolitografiutskrift, har fordeler og ulemper fra ulike perspektiver4. Blant disse teknikkene brukes ekstruderingsprosedyren oftest på grunn av kostnadseffektiviteten. Bioink spiller en nøkkelrolle i prosessen stabilitet av ekstrudering bioprinting. Den ideelle celle-laden bioink bør ikke bare være biokompatibel, men også være egnet for mekaniske egenskaper5. Bioinks med lav viskositet er vanligvis presentert som en flytende-lignende tilstand. Disse bioinks kan enkelt og raskt deponeres og unngå cellemembranskader forårsaket av høy skjærstress under ekstrudering. Men i komplekse tilfeller som krever langsiktige utskriftsperioder, gir lav viskositet ofte opphav til den uunngåelige sedimenteringen av de innkapslede cellene i bioinkreservoaret, som vanligvis drives av tyngdekraften og fører til en uforstyrret cellespredning i bioink6,7. Følgelig hindrer en bioink med inhomogen celledispergering in vitro bioprinting av en funksjonell vevskonstruksjon.
Flere nyere studier med fokus på bioinks har rapportert fremme av homogen dispersitet av innkapslede celler. En modifisert alginat bioink basert på dual-stage krysskobling ble brukt for ekstrudering bioprinting8. En alginatpolymer ble modifisert med peptider og proteiner i denne studien. Celler presenterte en mer homogen fordeling i denne modifiserte alginat enn i den vanlige alginat på grunn av festestedene som tilbys av peptidene og proteinene. Alternativt har blandede bioinks blitt brukt for å løse sedimentering av celler i bioink. En blandet bioink som inneholder polyetylenglykol (PEG) og gelatin eller gelatin metakryloyl (GelMA) med forbedret mekanisk robusthet ble brukt i en annen studie9. De innkapslede cellene presenterte en homogen fordeling hovedsakelig fordi viskositeten til den blandede bioinken ble forbedret. Generelt er det flere faktorer som påvirker dispergering av innkapslede celler i bioink, for eksempel viskositeten til bioink, tyngdekraften av cellene, tettheten av cellene, og varigheten av arbeidsperioden. Blant disse faktorene spiller tyngdekraften av celler en kritisk rolle i å fremme sedimentering. Oppdrift og friksjon gitt av viskøse bioink har blitt undersøkt som de viktigste kreftene mot tyngdekraften til dags dato10.
Her utviklet vi en ny strategi for å fremme homogen spredning av de innkapslede cellene i bioink ved å manipulere flere flytende grensesnitt i bioinkreservoaret. Disse flytende grensesnittene som er opprettet av flerlagsmodifisering av bioink, kan ikke bare gi interfacial oppbevaring, som forsinker sedimenteringen av celler, men opprettholder også en passende biokompatibilitet og reologisk oppførsel av bioink. I praksis endret vi vandig GelMA-løsning (5%, w/v) med silkefibroin (SF) på en flerlags måte for å langsgående produsere fire grensesnitt, noe som gir interfacial spenninger i blandet bioink. Som et resultat ble tyngdekraften som lastet på cellene motvirket av den menneskeskapte interfaciale spenningen, og en nesten homogen spredning av de innkapslede cellene i bioink ble oppnådd på grunn av mindre sedimentering over de tilstøtende lagene av celler. Ingen lignende protokoll for å bremse sedimenteringen av innkapslede celler ved å manipulere interfacial oppbevaring i flytende bioinks har blitt rapportert til dags dato. Vi presenterer vår protokoll her for å demonstrere en ny måte å løse cellesedimentering på bioprinting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stabiliteten til flerlagssystemet er et nøkkelpunkt for å utføre denne protokollen med hell. Vi beregnet teoretisk diffusjon av SF-molekyler i GelMA-løsningen basert på Naumans studie13. Det ble funnet at spredningen av proteiner i løsningen var relatert til deres molekylvekt. Gjennomsnittlig molekylvekt (MW) av storfe serum albumin (BSA) er 66,5 kDa, og dens diffusjonskoeffisient er 64-72 μm2/ s. Gjennomsnittlig MW fibrinogen er 339,7 kDa, og diffusjonskoeffisienten er 23-34 μm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 og 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai kommunale vitenskap og teknologi store prosjekt (Grant nr. 2017SHZDZX01), og Shanghai kommunale utdanningskommisjon (Innovasjonsprogram 2017-01-07 -00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
