Använda flerskiktad Hydrogel Bioink i tredimensionell bioprinting för homogen cellfördelning
Summary
Här utvecklade vi en ny flerskiktad modifierad strategi för vätskeliknande bioinks (gelatinmetakryloyl med låg viskositet) för att förhindra sedimentering av inkapslade celler.
Abstract
Under den extruderingsbaserade tredimensionella bioprintingprocessen kan vätskeliknande bioinkar med låg viskositet skydda celler från membranskador som orsakas av skjuvstress och förbättra överlevnaden för de inkapslade cellerna. Den snabba gravitationsdrivna cellsedimenteringen i reservoaren kan dock leda till en inhomogen cellfördelning i biotryckta strukturer och därmed hindra tillämpningen av vätskeliknande bioinks. Här utvecklade vi en ny flerskiktad modifierad strategi för vätskeliknande bioinks (t.ex. gelatinmetakryloyl med låg viskositet) för att förhindra sedimentering av inkapslade celler. Flera flytande gränssnitt manipulerades i multilayered bioink att ge interfacial retention. Följaktligen var cell sedimentering åtgärder som går över intilliggande lager i flerskiktade systemet fördröjs i bioink reservoaren. det konstaterades att den interfacialretentionen var mycket högre än sedimental dragningskraften hos celler, vilket visar på en kritisk roll för den interfaciala retentionen när det gäller att förhindra cellsedimentation och främja en mer homogen spridning av celler i den flerskiktade bioinken.
Introduction
Tredimensionell (3D) bioprinting har varit en lovande metod för att tillverka komplexa arkitektoniska och funktionella kopior av inhemska vävnader i biofabricering och regenerativ medicin1,2,3. De gemensamma strategier för bioprinting, inklusive bläckstråleskrivare, extrudering och stereolitografi utskrift, har för-och nackdelar från olika perspektiv4. Bland dessa tekniker är extruderingsproceduren oftast används på grund av dess kostnadseffektivitet. Bioink spelar en nyckelroll i processen stabilitet extrudering bioprinting. Den idealiska cell-lastad bioink bör inte bara vara biokompatibel utan också vara lämplig för mekaniska egenskaper5. Bioinks med låg viskositet presenteras vanligtvis som ett flytande-liknande tillstånd. Dessa bioinks kan enkelt och snabbt deponeras och undvika cellmembranskador framkallas av hög skjuvning stress under extrudering. Men i komplexa fall som kräver långsiktiga tryckperioder, ger låg viskositet ofta upphov till den oundvikliga sedimenteringen av de inkapslade cellerna i bioinkbehållaren, som vanligtvis drivs av gravitationen och leder till en inhomogen cellspridning i bioink6,7. Följaktligen hämmar en bioink med inhomogen cell dispersitet in vitro bioprinting av en funktionell vävnad konstruktion.
Flera nyligen genomförda studier med fokus på bioinks har rapporterat främjande av homogen spridning av inkapslade celler. En modifierad alginatbioink baserad på dubbelstegstvärbindning användes för extrudering av bioprinting8. En alginatpolymer modifierades med peptider och proteiner i denna studie. Celler presenterade en mer homogen fördelning i denna modifierade alginat än i den vanliga alginat på grund av de tillbehör platser som tillhandahålls av peptiderna och proteinerna. Alternativt har blandade bioinks använts för att lösa sedimentering av celler i bioink. En blandad bioink som innehåller polyetylenglykol (PEG) och gelatin eller gelatinmetakryloyl (GelMA) med förbättrad mekanisk robusthet användes i en annan studie9. De inkapslade cellerna presenterade en homogen fördelning främst på grund av viskositeten hos den blandade bioink förbättrades. I allmänhet finns det flera faktorer som påverkar spridningen av de inkapslade cellerna i bioink, såsom viskositeten hos bioink, cellernas gravitation, cellernas densitet och arbetsperiodens varaktighet. Bland dessa faktorer spelar cellernas gravitation en avgörande roll för att främja sedimentering. Den flytkraft och friktion som den trögflytande bioink har undersökts som de viktigaste krafterna mot gravitationen hittills10.
Häri utvecklade vi en ny strategi för att främja homogen spridning av inkapslade celler i bioink genom att manipulera flera flytande gränssnitt i bioink reservoaren. Dessa flytande gränssnitt som skapats av flerskiktade modifiering av bioink kan inte bara ge interfacial retention, som fördröjer sedimentering av celler, men också upprätthålla en lämplig biokompatibilitet och reologiska beteende bioink. I praktiken modifierade vi vattenhaltig GelMA-lösning (5%, w/v) med silkefibroin (SF) på ett flerskiktat sätt för att längsgående producera fyra gränssnitt, vilket ger interfaciala spänningar i den blandade bioink. Som ett resultat, allvaret belastning på cellerna kompenserades av konstgjorda interfacial spänning, och en nästan homogen spridning av inkapslade celler i bioink erhölls på grund av mindre sedimentering över intilliggande lager av celler. Inget liknande protokoll för att bromsa sedimentering av inkapslade celler genom att manipulera interfacial retention i flytande bioinks har rapporterats hittills. Vi presenterar vårt protokoll här för att visa ett nytt sätt att lösa cellsedimentation i bioprinting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stabiliteten i det flerskiktade systemet är en viktig punkt för att utföra det här protokollet. Vi beräknade teoretiskt spridningen av SF-molekyler i GelMA-lösningen baserat på Naumans studie13. Det konstaterades att spridningen av proteiner i lösning var relaterad till deras molekylvikt. Den genomsnittliga molekylvikten (MW) av bovint serumalbumin (BSA) är 66,5 kDa och dess diffusionskoefficient är 64-72 μm2/s. Den genomsnittliga MW av fibrinogen är 339,7 kDa, och dess diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner bidrag från National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 och 81570422), Kinas nationella nyckelprogram för forskning och utveckling (2018YFC1005002), Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (bidrag nr 2017SHZDZX01) och Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
