Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre
Summary
Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.
Abstract
Les modèles de xénogreffe dérivés des patients sont essentiels pour définir comment différents cancers réagissent au traitement médicamenteux dans un système in vivo. Les modèles de souris sont la norme dans le domaine, mais le poisson zèbre a émergé comme un modèle alternatif avec plusieurs avantages, y compris la capacité pour le haut débit et le dépistage des médicaments à faible coût. Le poisson zèbre permet également le dépistage in vivo des médicaments avec un grand nombre de répliques qui n’étaient auparavant disponibles qu’avec des systèmes in vitro. La capacité d’effectuer rapidement des écrans de médicaments à grande échelle peut ouvrir la possibilité de la médecine personnalisée avec une traduction rapide des résultats de retour à la clinique. Les modèles de xénogreffe de poisson-zèbre pourraient également être employés pour dépister rapidement des mutations actionnables basées sur la réponse tumorale aux thérapies ciblées ou pour identifier de nouveaux composés anticancéreux des grandes bibliothèques. La principale limitation actuelle dans le domaine a été la quantification et l’automatisation du processus afin que les écrans de drogue puissent être effectués à plus grande échelle et être moins exigeants en main-d’œuvre. Nous avons mis au point un flux de travail pour les échantillons primaires de patients de xenografting dans les larves de poissons zèbres et effectuant des écrans de drogue à grande échelle utilisant une unité d’imagerie équipée de microscope de fluorescence et unité automatisée d’échantillonneur. Cette méthode permet la normalisation et la quantification de la zone tumorale engrafted et la réponse au traitement de drogue à travers un grand nombre de larves de poisson zèbre. Dans l’ensemble, cette méthode est avantageuse par rapport au dépistage traditionnel des médicaments de culture cellulaire car elle permet la croissance des cellules tumorales dans un environnement in vivo tout au long du traitement de drogue, et est plus pratique et rentable que les souris pour les écrans de drogue in vivo à grande échelle.
Introduction
Xenografting des cancers primaires de patient ou des lignées humaines de cellules cancéreuses dans les organismes modèles est une technique largement utilisée pour étudier la progression et le comportement de tumeur in vivo, la réponse de tumeur au traitement de drogue, et l’interaction de cellules cancéreuses avec le microenvironnement, entre autres. Traditionnellement, les cellules sont xénogreffées dans des souris immunodéprimées, ce qui reste la norme sur le terrain. Cependant, ce système modèle a plusieurs limitations, telles que le coût élevé, les nombres bas de réplique, les difficultés à quantifier avec précision la charge de tumeur in vivo, et le temps prolongé qu’il faut pour que les tumeurs à l’engraft et le test de drogue pour être accompli. Ces dernières années, le poisson zèbre est apparu comme un modèle alternatif de xénogreffe, avec le premier signalé en 2005, avec des lignées de cellules de mélanome humain étiquetées protéine fluorescente verte (GFP) transplantées dans des embryons de stade blastule1,2. Plus récemment, 2 jours après la fertilisation (dpf) larves de poisson zèbre ont été utilisés comme destinataires de xénogreffe pour permettre le contrôle de l’emplacement anatomique de l’injection et pour une utilisation dans l’imagerie in vivo à haute résolution de l’interaction tumorale avec le microenvironnement environnant3,4.
Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que modèle de xénogreffe. Tout d’abord, le poisson zèbre adulte peut être logé et rapidement élevé en grandes quantités à un coût relativement faible. Chaque paire d’accouplement de poissons zèbres adultes peut produire des centaines de poissons larvés par semaine. En raison de leur petite taille, ces poissons zèbres larvaires peuvent être maintenus dans des plaques de 96 puits pour le dépistage des médicaments à haut débit. Les larves n’ont pas besoin d’être nourries au cours d’une expérience typique de xénogreffe, car leur jaune-sac fournit les nutriments pour les soutenir pour leur première semaine de vie. En outre, les poissons zèbres n’ont pas un système immunitaire entièrement fonctionnel jusqu’à 7 dpf, ce qui signifie qu’ils ne nécessitent pas d’irradiation ou de régimes immunosuppresseurs avant l’injection de xénogreffe. Enfin, les lignes de poissons zèbres optiquement claires permettent l’imagerie à haute résolution des interactions tumeur-microenvironnement.
Peut-être l’application la plus prometteuse du poisson zèbre comme modèle de xénogreffe est la capacité d’effectuer le dépistage de médicaments à haut débit sur des échantillons de cancer humain d’une manière qui n’est pas possible en utilisant tout autre organisme modèle. Les larves absorbent les médicaments de l’eau à travers la peau, améliorant la facilité de l’administration de la drogue5. Étant donné que les animaux sont maintenus dans des assiettes de 96 puits, généralement dans 100 à 300 ll d’eau, les écrans nécessitent des quantités de médicaments plus petites que chez les souris. Actuellement, il existe plusieurs méthodes différentes pour la normalisation et la quantification de l’effet des médicaments sur le fardeau tumoral humain chez les poissons zèbres, dont certains sont plus pratiques que d’autres pour l’échelle des tests de dépistage de drogues simples à haut débit de dépistage. Par exemple, certains groupes dissocient les poissons en suspensions à cellule unique, et quantifient les cellules tumorales étiquetées fluorescentes ou tachées en imagerie des gouttelettes individuelles de la suspension et en quantifiant la fluorescence à l’aide d’une macro4imageJ semi-automatisée. Une méthode semi-automatisée d’imagerie des larves entières a été mise au point dans laquelle les poissons larvaire ont été fixés dans des plaques de 96 puits et photographiés à l’aide d’un microscope fluorescent inversé avant le réalignement des images composites et la quantification des foyers de cellules tumorales6. Ces deux essais sont des méthodes assez laborieuses pour la quantification, qui a rendu le dépistage de médicaments vraiment à haut débit dans les modèles de xénogreffe de poisson zèbre impraticable.
Cette question a été abordée par le développement de la technologie de dépistage automatisé des vertébrés (VAST) Bioimager et Large Particle (LP), une unité d’imagerie équipée d’un microscope à fluorescence et une unité d’échantillonneur automatisé(figure 1 et tableau des matériaux), qui est une méthode vraiment automatisée pour l’imagerie à haut débit des larves de poissons zèbres7,8,9. Avec cette unité, les poissons sont anesthésiés, échantillonnés automatiquement à partir d’une plaque de 96 puits, placés dans un capillaire et tournés dans l’orientation définie en fonction d’une préférence préétablique de l’utilisateur, photographié, puis soit remis dans le même puits d’une nouvelle plaque de 96 puits pour d’autres études ou jeté. La combinaison de cette technologie d’imagerie avec des xénogreffes de poisson zèbre peut permettre la possibilité d’un médicament personnalisé qui utilise le dépistage de médicaments à haut débit des grandes bibliothèques de composés de médicaments contre les tumeurs individuelles des patients. Les xénogreffes de poisson zèbre offrent également une méthode à grande échelle et à faible coût pour tester à la fois la toxicité et l’efficacité de nouveaux composés in vivo. Le poisson zèbre peut être utilisé comme étape préliminaire de dépistage avant de passer aux modèles de xénogreffe de souris.
Nous avons développé un flux de travail simplifié pour les cellules de leucémie des patients primaires de xenografting dans le poisson zèbre et effectuant des écrans de drogue à haut débit avec l’imagerie automatisée et la quantification, qui peuvent être appliquées à n’importe quelles autres cellules tumorales de patient primaire ou ligne de cellules cancéreuses. Ce flux de travail a utilisé une unité d’imagerie équipée de microscope de fluorescence et une unité d’échantillonneur automatisée pour améliorer les méthodes actuelles de normalisation et de quantification et offre une alternative automatisée aux méthodes précédentes et plus laborieuses de quantification de la masse tumorale in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons démontré une méthode normalisée pour la décongélation et l’injection des cellules laucémiques des patients primaires dans le poisson zèbre comme modèle de xénogreffe. Nous avons également établi un protocole pour le dépistage à haut débit des poissons zèbres xénogreffes à l’aide d’une unité d’imagerie équipée d’un microscope à fluorescence et d’une unité d’échantillonneur automatisé. Précédemment, des xénogreffes ont été rapportées avec des ligné…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par un V Foundation V Scholar Award et des NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (à J.S. Blackburn) et la subvention de formation des NIH T32CA165990 (à M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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