הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish
Summary
Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.
Abstract
החולה הנגזרים מודלים מבע הם קריטיים בהגדרת איך סרטן שונים להגיב לטיפול בסמים ב vivo system. מודלים של עכברים הם תקן בתחום, אבל דג זברה התפתחה כמודל אלטרנטיבי עם מספר יתרונות, כולל את היכולת של תפוקה גבוהה והקרנת סמים בעלות נמוכה. Zebrafish גם לאפשר בהקרנה vivo סמים עם מספרים שכפול גדול שהיו בעבר רק השגה עם מערכות חוץ גופית. היכולת לבצע במהירות מסכי סמים בקנה מידה גדול עשויים לפתוח את האפשרות לרפואה אישית עם תרגום מהיר של תוצאות חזרה למרפאה. Zebrafish מודלים מבע יכול לשמש גם מסך במהירות עבור מוטציות שימושי מבוסס על תגובת הגידול לטיפולים ייעודיים או כדי לזהות תרכובות אנטי סרטניים חדש מספריות גדולות. המגבלה העיקרית הנוכחית בתחום מהווה כמות ואוטומציה של התהליך כך שניתן יהיה לבצע מסכי סמים בקנה מידה גדול יותר ולהיות פחות בעלי עבודה. פיתחנו זרימת עבודה עבור דגימות המטופל הראשי xהשתלה לתוך הזחלים דג זברה וביצוע מסכי סמים בקנה מידה גדול באמצעות מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה. שיטה זו מאפשרת סטנדרטיזציה וכימות של אזור גידול מנופה ותגובה לטיפול בסמים על פני מספר גדול של הזחלים דג זברה. בסך הכל, שיטה זו היא יתרון על ההקרנה המסורתית התרופה בתרבות התא כפי שהוא מאפשר צמיחה של תאים סרטניים בסביבה vivo במהלך טיפול בסמים, והוא מעשי יותר וחסכוני יותר עכברים בקנה מידה גדול במסכים vivo סמים.
Introduction
Xenografting שתלה של סרטן החולה הראשי או סרטן האדם קווי תאים לתוך אורגניזמים מודל היא טכניקה נפוצה בשימוש כדי ללמוד התקדמות הגידול והתנהגות vivo, התגובה הגידול לטיפול בסמים, ואינטראקציה תא סרטן עם מיקרוסביבה, בין היתר. באופן מסורתי, תאים מושתלים בתוך עכברים שנפגעו ממערכת החיסון, וזה נשאר התקן בשדה. עם זאת, מערכת זו מודל יש מגבלות מספר, כגון עלות גבוהה, נמוך לשכפל מספרים, קשיים באופן מדויק העומס הגידול בvivo, ואת הזמן המורחב שלוקח גידולים כדי לעבור בדיקות וסמים כדי להסתיים. בשנים האחרונות, דג זברה התפתחה כמו מודל חלופי מבע, עם הראשון שדווחו ב 2005, עם חלבון פלורסנט ירוק (gfp)-התווית מלנומה האדם קו תאים מושתלים1לתוך blastula-שלבהעוברים 1,2. לאחרונה, 2 יום לאחר הפריה (dpf) דג זברה הזחלים שימשו כנמענים מבע כדי לאפשר שליטה של מיקום אנטומיים של הזרקה ולשימוש ברזולוציה גבוהה vivo הדמיה של אינטראקציה הגידול עם מיקרוסביבה המקיפה3,4.
Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמודל השתל מבע ראשית, ניתן לאכסן דגי מבוגרים ולגדל במהירות בכמויות גדולות בעלות נמוכה יחסית. יכול לייצר מאות. דגי זחל בשבוע בשל גודלם הקטן, ניתן לתחזק את הזחל הזה ב-96-לוחיות הרישוי לצורך הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. הזחלים לא צריך להיות מוזן במהלך ניסוי טיפוסי מבע, כמו שק החלמון שלהם מספק את החומרים המזינים לקיים אותם בשבוע הראשון שלהם של החיים. יתר על כן, דג זברה אין מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין עד 7 dpf, כלומר הם לא דורשים הקרנה או מדכאים חיסוני משטרי לפני הזרקת מבע. בסופו של דבר, קווי דג זברה ברורים לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גידול מיקרואקולוגיה.
אולי היישום המבטיח ביותר של דג זברה כמו מודל מבע היא היכולת לבצע הקרנת סמים בתפוקה גבוהה על דגימות סרטן האדם באופן שאינו אפשרי באמצעות כל אורגניזם מודל אחר. הזחלים סופגים סמים מהמים דרך העור, ומשפרים את קלות מינהל התרופות5. מכיוון שבעלי חיים נשמרים ב-96-צלחות, בדרך כלל ב-100-300 μL של מים, המסכים דורשים כמויות קטנות יותר של סמים בהשוואה לעכברים. כיום, ישנן מספר שיטות שונות לסטנדרטיזציה וכימות ההשפעה של תרופות על נטל הגידול האנושי של דג zebrafish, כמה מהם הם מעשיים יותר מאשר אחרים עבור שדרוג בדיקות סמים יחיד להקרנה בתפוקה גבוהה. לדוגמה, קבוצות מסוימות מנתק דגים לתוך השעיה תא בודד, ו לכמת בצורה פלואורוסקופים או תאים סרטניים מוכתם על ידי הדמיה של טיפות בודדות של ההשעיה וכימות זריחה באמצעות ImageJ חצי אוטומטי מאקרו4. חצי אוטומטי למחצה הזחלים שיטת הדמיה פותחה בו דגי זחל תוקנו ב 96-היטב צלחות והדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה לפני היישור של תמונות מרוכבים וכימות של הגידול בתוך התאים6. שני הצדדים האלה הם למעשה שיטות תובעניות לעבודה עבור כימות, אשר עשה באמת התפוקה בקצב גבוהה הקרנת סמים ב-דג זברה מודלים מבע מעשי.
בעיה זו טופלה על ידי התפתחות של בעלי חוליות הקרנה אוטומטית טכנולוגיה (המכריע) bioimager ו חלקיקים גדולים (LP) דוגם, מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי (איור 1 וטבלה של חומרים), שהיא שיטה אוטומטית באמת עבור תפוקה גבוהה הדמיה של הזחלים דג זברה7,8,9. עם יחידה זו, הדגים מורדם, שנדגמו באופן אוטומטי מצלחת 96-באר, ממוקם בקפילר ומסובבת לכיוון הגדרת מבוסס על העדפה משתמש מוגדרת מראש, התמונה, ולאחר מכן ממוקם בחזרה לתוך אותו טוב של הצלחת 96-באר חדש למחקרים נוספים או מושלך. שילוב זה טכנולוגיה הדמיה עם דג זברה xשתלי עשוי לאפשר את האפשרות של רפואה אישית המשתמשת הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של ספריות מתחם גדול סמים נגד גידולים החולה הפרט. זייברפיש xenografts גם להציע שיטה בקנה מידה גדול ובעלות נמוכה לבדיקת הן רעילות ויעילות של תרכובות הרומן ב vivo. Zebrafish יכול לשמש צעד הקרנה ראשונית לפני שתמשיך מודלים מבע העכבר.
פיתחנו זרימת עבודה יעילה עבור תאים מטופלים לוקמיה של החולה שתלה וביצוע מסכי סמים בתפוקה גבוהה עם הדמיה וכימות אוטומטי, אשר ניתן להחיל על כל התאים הראשוניים של החולה הראשי או קו התא של סרטן. זרימת עבודה זו מנוצל מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה יחידת דוגם אוטומטי כדי לשפר את התקינה הנוכחית שיטות כימות ומציעה חלופה אוטומטית הקודם, יותר העבודה אינטנסיבית שיטות של המסה הגידול לכמת ב vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, הדגמנו שיטה סטנדרטית להחדרה והזרקה של תאי לוקמיה של המטופל העיקרי לתוך דג דג זברה כמודל מבע. כמו כן הקמנו פרוטוקול עבור הקרנת התרופה בתפוקה גבוהה של דגי מכסימום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי. בעבר, שתלי xenografts עם קווי התאים האנושיים, וכימות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי פרס V המלומד הקרן v ו NIH מענקים DP2CA228043, R01CA227656 (ל ס בלקברן) ו NIH הדרכה מענק T32CA165990 (כדי מ Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
