Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen
Summary
Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.
Abstract
Von Patienten abgeleitete Xenograft-Modelle sind entscheidend für die Definition, wie verschiedene Krebsarten auf die medikamentöse Behandlung in einem In-vivo-System reagieren. Mausmodelle sind der Standard auf dem Gebiet, aber Zebrafische haben sich als alternatives Modell mit mehreren Vorteilen herauskristallisiert, einschließlich der Fähigkeit für High-Throughput und Low-Cost-Drogen-Screening. Zebrafische ermöglichen auch in vivo-Arzneimittelscreenings mit großen Replikationszahlen, die bisher nur mit In-vitro-Systemen erhältlich waren. Die Fähigkeit, schnell großflächige Arzneimittel-Screens durchzuführen, kann die Möglichkeit für personalisierte Medizin mit schneller Übersetzung der Ergebnisse zurück in die Klinik eröffnen. Zebrafish Xenograft-Modelle könnten auch verwendet werden, um schnell auf umsetzbare Mutationen basierend auf Tumorreaktionen auf gezielte Therapien zu überprüfen oder um neue Krebsabwehrverbindungen aus großen Bibliotheken zu identifizieren. Die aktuelle Hauptbeschränkung in diesem Bereich war die Quantifizierung und Automatisierung des Prozesses, so dass Drogenbildschirme in größerem Maßstab durchgeführt werden können und weniger arbeitsintensiv sind. Wir haben einen Workflow für die Xenogtransplantation von primären Patientenproben in Zebrafischlarven und die Durchführung von großflächigen Medikamentensieben mit einer mit Fluoreszenzmikroskop ausgestatteten Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Standardisierung und Quantifizierung des transplantierten Tumorbereichs und die Reaktion auf die medikamentöse Behandlung über eine große Anzahl von Zebrafischlarven. Insgesamt ist diese Methode vorteilhaft gegenüber dem herkömmlichen Zellkultur-Arzneimittel-Screening, da sie das Wachstum von Tumorzellen in einer In-vivo-Umgebung während der gesamten medikamentösen Behandlung ermöglicht und praktischer und kostengünstiger ist als Mäuse für groß angelegte In-vivo-Medikamenten-Screenings.
Introduction
Xenografting von Primärpatientenkrebs oder menschlichen Krebszelllinien in Modellorganismen ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Tumorprogression und des Verhaltens in vivo, der Tumorreaktion auf die medikamentöse Behandlung und der Interaktion von Krebszellen mit der Mikroumgebung. Traditionell werden Zellen in immungeschwächte Mäuse gexpfropt, und dies bleibt der Standard auf dem Gebiet. Dieses Modellsystem hat jedoch mehrere Einschränkungen, wie hohe Kosten, niedrige Replikationszahlen, Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizierung der Tumorbelastung in vivo und die längere Zeit, die es für die Transplantation von Tumoren und die Abgeschlossenheit von Medikamententests benötigt. In den letzten Jahren sind Zebrafische als alternatives Xenograft-Modell entstanden, wobei das erste im Jahr 2005 berichtet wurde, mit grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-markierten menschlichen Melanomzelllinien, die in Blastula-Stadium-Embryonentransplantiertwurden 1,2. In jüngerer Zeit wurden 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven als Xenograft-Empfänger verwendet, um die Kontrolle der anatomischen Injektionsortung zu ermöglichen und für den Einsatz in hochauflösender In-vivo-Bildgebung der Tumorinteraktion mit der umgebenden Mikroumgebung3,4.
Zebrafische bieten viele Vorteile als Xenograft-Modell. Erstens können erwachsene Zebrafische zu relativ geringen Kosten in großen Mengen untergebracht und gezüchtet werden. Jedes Paar erwachsener Zebrafische kann Hunderte von Larvenfischen pro Woche produzieren. Aufgrund ihrer geringen Größe können diese Larvenzebrafische in 96-Well-Platten für das Hochdurchsatz-Drogenscreening aufbewahrt werden. Larven müssen nicht im Rahmen eines typischen Xenograft-Experiments gefüttert werden, da ihr Eigelbsack die Nährstoffe liefert, um sie für ihre erste Lebenswoche zu erhalten. Darüber hinaus haben Zebrafische erst 7 dpf ein voll funktionsfähiges Immunsystem, was bedeutet, dass sie vor der Xenograft-Injektion keine Bestrahlung oder immunsuppressive Therapien benötigen. Schließlich ermöglichen optisch klare Zebrafischlinien eine hochauflösende Abbildung von Tumor-Mikro-Umgebungen.
Die vielleicht vielversprechendste Anwendung von Zebrafischen als Xenograft-Modell ist die Fähigkeit, drogenstarke Untersuchungen an menschlichen Krebsproben auf eine Weise durchzuführen, die mit keinem anderen Modellorganismus möglich ist. Larven absorbieren Medikamente aus dem Wasser durch die Haut, Verbesserung der Leichtigkeit der Medikamentenadministration5. Da Tiere in 96-Well-Platten gehalten werden, in der Regel in 100 bis 300 l Wasser, erfordern Sie kleinere Wirkstoffmengen im Vergleich zu Mäusen. Derzeit gibt es mehrere verschiedene Methoden zur Standardisierung und Quantifizierung der Wirkung von Medikamenten auf die menschliche Tumorbelastung bei Zebrafischen, von denen einige praktischer sind als andere für die Ausweitung einzelner Arzneimitteltests auf ein Hochdurchsatz-Screening. Einige Gruppen dissoziieren beispielsweise Fische in einzelzellige Suspensionen und quantifizieren fluoreszierend oder gefärbte Tumorzellen, indem sie einzelne Tröpfchen der Suspension bildgeben und die Fluoreszenz mit einem halbautomatischen ImageJ-Makro4quantifizieren. Es wurde ein halbautomatisches Ganzlarven-Bildgebungsverfahren entwickelt, bei dem Larvenfische in 96-Well-Platten fixiert und mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor der Neuausrichtung von zusammengesetzten Bildern und der Quantifizierung von Tumorzellfoci6abgebildet wurden. Beide Assays sind ziemlich arbeitsintensive Methoden zur Quantifizierung, die wirklich High-Throughput-Drogen-Screening in Zebrafisch Xenograft Modelle unpraktisch gemacht hat.
Dieses Problem wurde durch die Entwicklung der Wirbeltier-Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, einer fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungseinheit und automatisierten Probenehmereinheit (Abbildung 1 und Tabelle der Materialien) angegangen, die eine wirklich automatisierte Methode zur Hochdurchsatz-Bildgebung von Zebrafischlarven7,8,9ist. Mit dieser Einheit werden Fische beäpftisiert, automatisch aus einer 96-Well-Platte entnommen, in einer Kapillare positioniert und auf der Grundlage einer voreingestellten Benutzerpräferenz in die eingestellte Ausrichtung gedreht, abgebildet und dann entweder für weitere Studien in den gleichen Brunnen einer neuen 96-Well-Platte gelegt oder verworfen. Die Kombination dieser bildgebenden Technologie mit Zebrafisch-Xenografts kann die Möglichkeit einer personalisierten Medizin ermöglichen, die ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening großer Arzneimittelbibliotheken gegen einzelne Patiententumoren verwendet. Zebrafish Xenografts bieten auch eine groß angelegte und kostengünstige Methode zur Prüfung sowohl der Toxizität als auch der Wirksamkeit neuartiger Verbindungen in vivo. Zebrafische können als vorderer Screening-Schritt verwendet werden, bevor Sie zu Maus-Xenograft-Modellen übergehen.
Wir haben einen optimierten Workflow für die Xenogtransplantation von primären Leukämiezellen von Patienten in Zebrafische entwickelt und durchführen hochdurchsatzige Arzneimittelbildschirme mit automatisierter Bildgebung und Quantifizierung, die auf alle anderen primären Tumorzellen oder Krebszelllinien angewendet werden können. Dieser Workflow nutzte eine mit Fluoreszenzmikroskop ausgestattete Bildgebungseinheit und eine automatisierte Probenehmereinheit, um aktuelle Standardisierungs- und Quantifizierungsmethoden zu verbessern und bietet eine automatisierte Alternative zu früheren, arbeitsintensiveren Methoden zur Quantifizierung der Tumormasse in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine standardisierte Methode zum Auftauen und Einspritzen von primären Leukämiezellen bei Patienten in Zebrafische als Xenograft-Modell demonstriert. Wir haben auch ein Protokoll für das Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening von xenografierten Zebrafischen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit erstellt. Bisher wurden Xenografts mit menschlichen Zelllinien berichtet, und die Quantifizierung von xenografted Tumoren in einer Hochdurchsa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch einen V Foundation V Scholar Award und NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (zu J.S. Blackburn) und NIH Training Grant T32CA165990 (an M.G. Haney) unterstützt.
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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