ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング
Summary
ゼブラフィッシュ異種移植片モデルは、生体内微小環境におけるヒト癌細胞のハイスループット薬物スクリーニングおよび蛍光イメージングを可能にする。当社は、自動蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットを用いて、ゼブラフィッシュにおける患者由来白血病サンプルに対する大規模な自動薬物スクリーニングのワークフローを開発しました。
Abstract
患者由来の異種移植片モデルは、インビボ系における薬物治療に対する異なる癌の反応を定義する上で重要である。マウスモデルは分野の標準ですが、ゼブラフィッシュは、高スループットおよび低コストの薬物スクリーニングの能力を含むいくつかの利点を持つ代替モデルとして登場しています。ゼブラフィッシュはまた、以前はインビトロシステムでのみ得られた大きな複製数でインビボ薬物スクリーニングを可能にする。大規模な薬物スクリーンを迅速に実行する能力は、結果をクリニックに迅速に翻訳してパーソナライズされた医療の可能性を開く可能性があります。ゼブラフィッシュ異種移植モデルは、標的療法に対する腫瘍応答に基づいて作用可能な突然変異を迅速にスクリーニングしたり、大規模なライブラリから新しい抗癌化合物を同定したりするためにも使用できる。この分野の現在の主な制限は、薬物スクリーンがより大きな規模で行われ、労働集約的でないようにプロセスを定量化し、自動化することです。我々は、ゼブラフィッシュ幼虫に一次患者のサンプルを異種移植し、蛍光顕微鏡を装備したイメージングユニットと自動サンプラーユニットを使用して大規模な薬物スクリーンを実行するためのワークフローを開発しました。この方法は、生着腫瘍領域の標準化と定量化と、多数のゼブラフィッシュ幼虫にわたる薬物治療への応答を可能にする。全体的に見て、この方法は、薬物治療を通じて生体内環境で腫瘍細胞の増殖を可能にするため、従来の細胞培養薬スクリーニングよりも有利であり、インビボ内の薬物スクリーンの大規模なマウスよりも実用的かつ費用対効果が高い。
Introduction
原発性患者癌またはヒト癌細胞株をモデル生物に異種移植することは、生体内での腫瘍の進行および行動、薬物治療に対する腫瘍応答、および微小環境との癌細胞相互作用を研究するために広く使用されている技術である。従来、細胞は免疫不全マウスに異種移植され、これは分野の標準のままです。しかし、このモデルシステムには、高コスト、低複製数、生体内での腫瘍負担を正確に定量化する難さ、腫瘍の生着や薬物検査にかかる時間の延長など、いくつかの制限があります。近年、ゼブラフィッシュは代替異種移植モデルとして登場し、2005年に最初に報告され、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識ヒト黒色腫細胞株がブラツラ期胚11,22に移植された。さらに最近では、2日間のポスト受精(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫が異種移植片のレシピエントとして使用され、周囲の微小環境33,44との腫瘍相互作用の生体内イメージングにおける解像の高分解能の制御を可能にしている。
ゼブラフィッシュは、異種移植片モデルとして多くの利点を提供します。まず、成虫のゼブラフィッシュは比較的低コストで大量に飼育し、迅速に飼育することができます。成類ゼブラフィッシュの各交配ペアは、週に何百もの幼虫の魚を生産することができます。サイズが小さいため、これらの幼虫ゼブラフィッシュは、ハイスループットの薬物スクリーニングのために96ウェルプレートで維持することができます。幼虫は、黄身嚢が人生の最初の週にそれらを維持するための栄養素を提供するので、典型的な異種移植片実験の過程で供給される必要はありません。さらに、ゼブラフィッシュは7dpfまで完全に機能する免疫系を持たないため、異種移植片注射の前に照射や免疫抑制レジメンを必要としません。最後に、光学的に透明なゼブラフィッシュラインは、腫瘍-微小環境相互作用の高解像度イメージングを可能にする。
ゼブラフィッシュを異種移植モデルとして最も有望な応用は、他のモデル生物を使用できない方法でヒト癌サンプルに対してハイスループット薬物スクリーニングを行う能力である。幼虫は皮膚を通して水から薬物を吸収し、薬物投与の容易さを高める5.動物は96ウェルプレート(通常は100〜300 μLの水)に維持されるため、スクリーンはマウスに比べて薬物量が少なく必要があります。現在、ゼブラフィッシュのヒト腫瘍負担に対する薬物の効果を標準化および定量化するためのいくつかの異なる方法があり、そのうちのいくつかは、ハイスループットスクリーニングに単一の薬物検査をスケールアップするために他のものよりも実用的である。例えば、一部のグループは、魚を単一細胞懸濁液に解像し、半自動化されたImageJマクロ4を用いて懸濁液の個々の液滴をイメージングし蛍光を定量することにより、蛍光標識または染色された腫瘍細胞を定量する。半自動化された全幼虫イメージング法を開発し、幼虫魚を96ウェルプレートに固定し、反転蛍光顕微鏡を使用して画像化した後、複合画像の再調整と腫瘍細胞病巣6の定量化を行った。これらのアッセイはどちらも定量化のためのかなり労働集約的な方法であり、ゼブラフィッシュ異種移植片モデルにおける真に高スループットの薬物スクリーニングを非現実的なものにしている。
この問題は、脊椎動物自動スクリーニング技術(VAST)バイオイケマと大粒子(LP)サンプラー、蛍光顕微鏡搭載イメージングユニット、自動サンプラーユニット(図1および7,8,材料表)の開発によって解決されました。このユニットでは、魚は麻酔をかけ、96ウェルプレートから自動的にサンプリングされ、毛細血管に配置され、プリセットユーザーの好みに基づいて設定された方向に回転し、画像化され、さらに研究のために新しい96ウェルプレートの同じ井戸に戻すか、廃棄されます。このイメージング技術とゼブラフィッシュ異種移植片を組み合わせることで、個々の患者腫瘍に対する大型薬物化合物ライブラリーのハイスループット薬物スクリーニングを使用する個別化医療の可能性が可能になる可能性があります。ゼブラフィッシュ異種移植片はまた、生体内の新しい化合物の毒性と有効性の両方をテストするための大規模かつ低コストの方法を提供します。ゼブラフィッシュは、マウス異種移植モデルに進む前に予備スクリーニングステップとして使用することができます。
私たちは、ゼブラフィッシュに原発性患者白血病細胞を異種移植し、他の原発性腫瘍細胞または癌細胞株に適用できる自動イメージングと定量化を備えた高性能薬物スクリーンを実行するための合理化されたワークフローを開発しました。このワークフローは、蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットと自動サンプラーユニットを使用して、現在の標準化および定量方法を改善し、生体内で腫瘍質量を定量化する以前のより労働集約的な方法に代わる自動化された代替手段を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ゼブラフィッシュへの一次患者白血病細胞の解凍および注入を異種移植モデルとして標準化された方法で実証した。また、蛍光顕微鏡搭載イメージングユニットと自動サンプラーユニットを用いたゼブラフィッシュのハイスループット薬物スクリーニングプロトコルを確立しました。これまで、異種移植片はヒト細胞株で報告されており、異種移植腫瘍の定量はハイスループッ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、V財団Vスカラー賞とNIHグランツDP2CA228043、R01CA227656(J.S.ブラックバーンへ)、NIHトレーニンググラントT32CA165990(M.G.ヘイニーへ)によって支援されました。
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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