Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish
Summary
Zebrafish xenograft modeller möjliggör hög genomströmning läkemedelsscreening och fluorescerande avbildning av mänskliga cancerceller i en in vivo mikromiljö. Vi utvecklade ett arbetsflöde för storskalig, automatiserad läkemedelsscreening på patientbaserade leukemiprover i zebrafiskar med hjälp av en automatiserad fluorescensmikroskop utrustad bildenhet.
Abstract
Patientbaserade xenograftmodeller är avgörande för att definiera hur olika cancerformer svarar på läkemedelsbehandling i ett in vivo-system. Musmodeller är standard på området, men zebrafiskar har vuxit fram som en alternativ modell med flera fördelar, bland annat möjligheten till hög genomströmning och billig drogscreening. Zebrafisk möjliggör också in vivo drogscreening med stora replikattal som tidigare endast kunde erhållas med in vitro-system. Förmågan att snabbt utföra storskaliga läkemedelsskärmar kan öppna upp möjligheten för personlig medicin med snabb översättning av resultat tillbaka till kliniken. Zebrafish xenograft modeller kan också användas för att snabbt skärmen för användbara mutationer baserat på tumör svar på riktade terapier eller för att identifiera nya anti-cancer föreningar från stora bibliotek. Den nuvarande stora begränsningen inom området har kvantifierat och automatiserat processen så att läkemedelsskärmar kan göras i större skala och vara mindre arbetsintensiva. Vi har utvecklat ett arbetsflöde för att xenografting primära patientprover i zebrafisklarver och utföra storskaliga läkemedelsskärmar med hjälp av en fluorescensmikroskop utrustad bildenhet och automatiserad sampler enhet. Denna metod möjliggör standardisering och kvantifiering av engrafted tumörområde och svar på läkemedelsbehandling över ett stort antal zebrafisklarver. Sammantaget är denna metod fördelaktigt jämfört med traditionell cellkultur drog screening eftersom det möjliggör tillväxt av tumörceller i en in vivo miljö under hela läkemedelsbehandling, och är mer praktisk och kostnadseffektiv än möss för storskaliga in vivo läkemedelsskärmar.
Introduction
Xenografting av primära patientcancer eller mänskliga cancer cellinjer i modellorganismer är en allmänt använd teknik för att studera tumör progression och beteende in vivo, tumör svar på läkemedelsbehandling, och cancer cell interaktion med mikromiljön, bland annat. Traditionellt är celler xenografted i immun-äventyras möss, och detta är fortfarande standard i fältet. Emellertid, denna modell system har flera begränsningar, såsom höga kostnader, låga replikera nummer, svårigheter att exakt kvantifiera tumör börda in vivo, och den förlängda tid som det tar för tumörer att engraft och drogtester som skall slutföras. Under de senaste åren har zebrafiskar vuxit fram som en alternativ xenograft modell, med den första rapporteras i 2005, med grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt humant melanom cellinjer transplanteras till blastula-steg embryon1,2. På senare tid har 2 dagars post-befruktning (dpf) zebrafisklarver använts som xenograft mottagare för att möjliggöra kontroll av anatomisk placering av injektion och för användning i hög upplösning in vivo imaging av tumör interaktion med den omgivande mikromiljö3,4.
Zebrafish erbjuder många fördelar som xenograftmodell. För det första kan vuxna zebrafiskar inhysas och snabbt födas upp i stora mängder till en relativt låg kostnad. Varje parning par vuxna zebrafiskar kan producera hundratals larvfisk per vecka. På grund av sin ringa storlek kan dessa larv zebrafiskar underhållas i 96-brunnsplattor för drogscreening med hög genomströmning. Larver behöver inte matas under loppet av ett typiskt xenograftexperiment, eftersom deras äggula-säck ger näringsämnen för att upprätthålla dem under sin första vecka i livet. Dessutom har zebrafiskar inte ett fullt fungerande immunsystem förrän 7 dpf, vilket innebär att de inte kräver bestrålning eller immunsuppressiva regimer före xenograft injektion. Slutligen, optiskt tydliga zebrafisk linjer möjliggör högupplöst avbildning av tumör-mikromiljö interaktioner.
Kanske den mest lovande tillämpningen av zebrafisk som en xenograft modell är förmågan att utföra hög genomströmning läkemedelsscreening på mänskliga cancerprover på ett sätt som inte är möjligt att använda någon annan modell organism. Larver absorberar droger från vattnet genom huden, vilket ökar nyttan av läkemedelsadministration5. Eftersom djur hålls i 96-brunnsplattor, vanligtvis i 100−300 μl vatten, kräver skärmar mindre läkemedelsmängder jämfört med möss. För närvarande finns det flera olika metoder för standardisering och kvantifiering av effekten av läkemedel på mänskliga tumör börda i zebrafisk, av vilka några är mer praktiska än andra för uppskalning enda drogtester till hög genomströmning screening. Till exempel, vissa grupper separera fisk i encelliga suspensioner, och kvantifiera fluorescerande märkta eller färgade tumörceller genom att avbilda enskilda droppar av suspensionen och kvantifiera fluorescens med hjälp av en halvautomatisk ImageJ makro4. En halvautomatisk hellarv imaging metod utvecklades där larvfisk fastställdes i 96-väl plattor och avbildas med hjälp av en inverterad fluorescerande mikroskop innan omjustering av sammansatta bilder och kvantifiering av tumörcellfoci6. Båda dessa analyser är ganska arbetsintensiva metoder för kvantifiering, vilket har gjort verkligt hög genomströmning drog screening i zebrafish xenograft modeller opraktiskt.
Detta problem har åtgärdats genom utvecklingen av vertebrate automated screening technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, en fluorescensmikroskop utrustad bildenhet och automatiserad provtagare enhet (figur 1 och tabell över material), som är en verkligt automatiserad metod för hög genomströmning imaging av zebrafisk larver7,,8,9. Med denna enhet, fisk sövs, provsatts automatiskt från en 96-brunn platta, placerad i en kapillär och roteras i den inställda orienteringen baserat på en förinställd användarpreferens, avbildas, och sedan antingen placeras tillbaka i samma brunn av en ny 96-brunn platta för ytterligare studier eller kasseras. Kombinera denna bildframställning teknik med zebrafish xenografts kan möjliggöra möjligheten att personlig medicin som använder hög genomströmning drog screening av stora drog sammansatta bibliotek mot enskilda patienttumörer. Zebrafish xenografts erbjuder också en storskalig och billig metod för att testa både toxicitet och effekt av nya föreningar in vivo. Zebrafiskar kan användas som ett preliminärt screeningsteg innan man fortsätter till mus xenograft modeller.
Vi har utvecklat ett strömlinjeformat arbetsflöde för xenografting primära patienten leukemi celler till zebrafisk och utför hög genomströmning läkemedelsskärmar med automatiserad avbildning och kvantifiering, som kan tillämpas på alla andra primära patienttumörceller eller cancer cellinje. Detta arbetsflöde utnyttjas en fluorescens mikroskop utrustade imaging enhet och automatiserad sampler enhet för att förbättra på nuvarande standardisering och kvantifiering metoder och erbjuder ett automatiserat alternativ till tidigare, mer arbetsintensiva metoder för att kvantifiera tumör massa in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie visade vi en standardiserad metod för upptining och injektion av primära patienten leukemi celler i zebrafish som en xenograft modell. Vi etablerade också ett protokoll för hög genomströmning drog screening av xenografted zebrafisk med hjälp av en fluorescens mikroskop utrustad bildhantering enhet och automatiserad sampler enhet. Tidigare har xenografts rapporterats med mänskliga cellinjer, och kvantifiering av xenografted tumörer i en hög genomströmning sätt har varit en utmaning i området. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av en V Foundation V Scholar Award och NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (till JS Blackburn) och NIH Training Grant T32CA165990 (till M.G. Haney).
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
