فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay
Summary
لقد قمنا بتحسين مستقبلات هرمون الاستروجين المتاحة تجاريا β مقولي فحص الأطعمة الرئيسية البشرية وغير البشرية لنشاط إستروجين. نحن التحقق من صحة هذا الفحص من خلال إظهار أن الغذاء البشري استروجين معروف فول الصويا يسجل عالية، في حين أن الأطعمة الأخرى تظهر أي نشاط.
Abstract
النباتات هي مصدر للغذاء لكثير من الحيوانات، وأنها يمكن أن تنتج الآلاف من المواد الكيميائية. بعض هذه المركبات تؤثر على العمليات الفسيولوجية في الفقاريات التي تستهلك لهم، مثل وظيفة الغدد الصماء. Phytoestrogens، الأكثر دراسة جيدا الغدد الصماء النشطة المواد الكيميائية النباتية، تتفاعل مباشرة مع محور gonadal تحت الغدة النخامية hypothalamo من نظام الغدد الصماء الفقاريات. هنا نقدم استخدام رواية من الخلية القائمة على مقايسة لفحص المستخلصات النباتية لوجود المركبات التي استروجين النشاط البيولوجي. يستخدم هذا الفحص خلايا الثدييات المهندسة للتعبير عن مستقبلات الإستروجين (ERβ) التي تم نقلها مع جين luciferase. التعرض للمركبات مع النشاط الاستروجيني النتائج في الخلايا المنتجة للضوء. هذا الفحص هو وسيلة موثوقة وبسيطة لاختبار النشاط استروجين البيولوجية. لديها العديد من التحسينات على مقايسات عابرة عابرة، وأبرزها، سهولة الاستخدام، واستقرار الخلايا، وحساسية من الفحص.
Introduction
النباتات هي مصدر ضروري للغذاء لكثير من الحيوانات، وتوفير السعرات الحرارية والمواد المغذية الحاسمة للبقاء على قيد الحياة، والتكاثر، والنمو، والتنمية، والسلوك1. تنتج النباتات الآلاف من المواد الكيميائية، وكثير منها كتكييفات لنموها الخاص، والصيانة التناسخية، والتكاثر. مركبات أخرى, يعتبر الأيض النباتية الثانوية (PSMs), لها وظائف أقل وضوحا, على الرغم من أن بعض سامة ومن المرجح أن تستخدم كدفاع ضد شعيرات وتطفلية (على سبيل المثال, قلويدات, العفص)2,3. بعض هذه المواد الكيميائية لديها القدرة على التأثير على العمليات الفسيولوجية على المدى الطويل في الحيوانات، مثل وظائف الغدد الصماء، على الرغم من أن السبب في هذه المواد الكيميائية النباتية النشطة الغدد الصماء تتفاعل مع نظام الغدد الصماء الفقاريات لا يزال غير واضح2،4.
Phytoestrogens، الأكثر دراسة جيدا الغدد الصماء النشطة المواد الكيميائية النباتية، هي PSMs بوليفينوليك التي تحاكي هيكليا ووظيفيا الاستروجين، والتفاعل مباشرة مع محور gonadal تحت النخامية تحت النخامية من نظام الغدد الصماء الفقارية5. ابتلاع فيتويستروغنز في النظام الغذائي البشري يرتبط مع الحماية ضد بعض أنواع السرطان, أمراض القلب, وأعراض انقطاع الطمث, على الرغم من آثار أخرى تشمل مشاكل الخصوبة. في الواقع، تم اكتشاف الآثار الفسيولوجية لهذه المركبات في 1940s عندما العقم في الأغنام كان يعزى إلى رعيهم على البرسيم النباتي الغني(Trifolium subterrareum)6. عند تناولها، يمكن أن تنتقل فيتويستروغنز إلى الخلايا وتقليد آثار هرمون الاستروجين. في حين أن فيتويستروغنز له آثار سلبية على خصوبة الأغنام، والعلاقة بين فيتويستروغنز وعلم وظائف الأعضاء ليست بسيطة. مثل الأغنام، يظهر وحيد القرن الأبيض الجنوبي حساسية للمركبات الإستروجينية في الأعلاف المشتقة من كميات عالية من الصويا والبرسيم. بنات الإناث تغذية هذا النظام الغذائي أثناء الحمل هم أقل عرضة للتكاثر7. ومع ذلك، فقد أظهرت دراسات أخرى أن فيتويستروغنز قد يكون لها آثار إيجابية كذلك، بما في ذلك نضوج بصيلات المبيض في الفئران القديمة8، والوقاية من بعض أنواع السرطان، والنشاط المضادة للأكسدة، وآثار مضادة للبروبروليفية9.
اتساع آثار فيتويستروغنز ليست مفاجئة نظرا لأن هرمون الاستروجين تؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية, بما في ذلك النمو, التنمية, وتنظيم الجهاز العصبي الإنجابية والمركزية10. على الرغم من أن هناك العديد من آليات العمل, فيتويستروغنز غالبا ما يكون القدرة على تعديل, تعزيز, أو تعطيل إشارات هرمون الاستروجين من خلال قدرتها على العمل كيغاندس لمستقبلات هرمون الاستروجين داخل النواة ألفا وبيتا (ERα وERβ). العديد من فيتويستروغنز لديها بنية حلقة فينولية مماثلة لهرمون الاستروجين الذي يسمح لهم لربط مستقبلات هرمون الاستروجين. أولئك الذين لديهم وظيفة النشاط الاستروجيني ناهض مثل هرمون الاستروجين، وتشكيل تنشيط ER-ligand المعقدة التي يمكن أن يمتم ربطها عنصر استجابة هرمون الاستروجين (ERE) وتحريك النسخ الجيني11. وهكذا، هرمون الاستروجين وفيتويستروغنز تنظيم نشاط الخلية ووظائف النظام من خلال أعمالهم كعوامل النسخ.
هنا نقدم استخدام رواية من الخلية القائمة على مقايسة لفحص المستخلصات النباتية لوجود المركبات التي استروجين النشاط البيولوجي. يستخدم هذا الفحص الخلايا الصينية الصينية CHO المبيض الهامستر المهندسة لERβ التعبير عن للغاية, التي تم transed مع اليراعات (Photinus pyralis) لوسيفيراز جين مرتبطة المروج ERE12. عندما تكون المركبات الإستروجين موجودة، فإنها ترتبط إلى ER، يمرم، وربط إلى ERE، مما يؤدي إلى نسخ الجين luciferase. عند إضافة محلول الركيزة ، يحفز luciferase رد فعل يؤدي إلى انبعاث الفوتون. ولذلك، تعطي عينات إيجابية عينات الضوء والسلبية لا.
هذا المقايسة المتاحة تجاريا يلغي الحاجة إلى مختبرات نقل الخلايا الثديية مع مستقبلات الجينات والإستروجين مراسل13,14, الذي كان غير مستقر ومتغير في فعالية. يوفر المقايسة منصة مستقرة transfection التي تسمح بسرعة وببساطة تحديد ما إذا كان المصنع لديه نشاط استروجين عبر مستقبلات ملزمة.
نحن اختبار فرضية أن فول الصويا لديها نشاط استروجين أعلى من جميع الأطعمة الأخرى نظرا لتركيزات معروفة من الإيسوفلافوناتإستروجين 15 باستخدام الأطعمة البشرية من البقالين المحليين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وERβ مقايسة مراسل وضعت لفحص فردي وكلاء الأدوية هي أيضا مناسبة لفحص الأغذية النباتية ل phytoestrogens النشطة بيولوجيا من خلال ERβ. وتشمل الاعتبارات الهامة في البروتوكول معالجة عينات النباتات بعناية: المواد النباتية الطازجة تحتاج إلى تجفيف بسرعة لمنع صب أو التحلل البيولوجي الأخرى، وأنه يحتاج إلى أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب شاكرون لدال Leitman للتدريب الأولي في استخدام المقايسات العابرة لتحديد النشاط الاستروجيني للأغذية النباتية الرئيسيات. بفضل برادفورد ويستريتش وC. اريك جونسون للمساعدة في إعداد معدات المختبر وتدريب الطلاب على أساليب الاستخراج. وأخيراً، شكراً لجامعة إنديانا على تمويل هذا البحث.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. . Primate Diet & Nutrition. , (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -. i., et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- . . Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3′-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. . Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. . Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).
