Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay
Summary
Otimizamos um receptor de estrogênio comercialmente disponível β ensaio para triagem de alimentos primatas humanos e não humanos para atividade estrogênica. Validamos este ensaio mostrando que a conhecida soja humana estrogênica registra alta, enquanto outros alimentos não mostram atividade.
Abstract
As plantas são uma fonte de alimento para muitos animais, e podem produzir milhares de produtos químicos. Alguns desses compostos afetam processos fisiológicos nos vertebrados que os consomem, como a função endócrina. Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endócrinos mais bem estudados, interagem diretamente com o eixo gândalo hipotalmo-pituitário do sistema endócrino vertebrado. Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de mamíferos projetadas para expressar altamente o receptor de estrogênio beta (ERβ) e que foram transfectadas com um gene de luciferase. A exposição a compostos com atividade estrogênica resulta nas células produtoras de luz. Este ensaio é uma maneira confiável e simples de testar a atividade estrogênica biológica. Possui várias melhorias em relação aos ensaios transitórios de transfecção, mais notavelmente, à facilidade de uso, à estabilidade das células e à sensibilidade do ensaio.
Introduction
As plantas são uma fonte necessária de alimento para muitos animais, fornecendo calorias e nutrientes críticos à sobrevivência, reprodução, crescimento, desenvolvimento e comportamento1. As plantas produzem milhares de produtos químicos, muitos como adaptações para seu próprio crescimento, manutenção e reprodução estomáticas. Outros compostos, considerados metabólitos secundários vegetais (PSMs), têm funções menos claras, embora algumas sejam tóxicas e provavelmente usadas como defesa contra herbívoro e parasitismo (por exemplo, alcaloides, taninos)2,3. Alguns desses produtos químicos têm a capacidade de afetar processos fisiológicos de longo prazo em animais, como o funcionamento endócrino, embora por que esses fitoquímicos endócrinos-ativos interagem com o sistema endócrino vertebrado ainda não está claro2,4.
Os fitoestrogênios, os fitoquímicos endocrinos mais bem estudados, são PSMs polifenóficos que imitam estrutural e funcionalmente estrogênios, interagindo diretamente com o eixo gânico hipotalmo-pituitário do sistema endócrinovertebrado 5. A ingestão de fitoestrogênios na dieta humana está associada à proteção contra alguns cânceres, doenças cardíacas e sintomas da menopausa, embora outros efeitos incluam problemas de fertilidade. De fato, os efeitos fisiológicos desses compostos foram descobertos na década de 1940, quando a infertilidade em ovelhas foi atribuída ao seu pasto no trevo rico em fitoestrogênio(Trifolium subterrareum)6. Quando ingeridos, fitoestrogênios podem passar para as células e imitar os efeitos do estrogênio. Embora os fitoestrogênios tivessem efeitos negativos na fertilidade das ovelhas, a relação entre fitoestrogênios e fisiologia não é simples. Como ovelhas, rinocerontes brancos do sul apresentam sensibilidade a compostos estrogênicos em ração derivada de altas quantidades de soja e alfafa. Filhas de mulheres alimentadas com essa dieta durante a gravidez são menos propensas a se reproduzir7. No entanto, outros estudos têm demonstrado que fitoestrogênios também podem ter efeitos positivos, incluindo a maturação de folículos ovarianos em camundongos mais velhos8, prevenção de certos cânceres, atividade antioxidante e efeitos antiproliferativos9.
A amplitude dos efeitos dos fitoestrogênios não é surpreendente, dado que os estrogênios afetam uma ampla gama de funções biológicas, incluindo crescimento, desenvolvimento e regulação dos sistemas nervosos reprodutivos e centrais10. Embora existam muitos mecanismos de ação, fitoestrogênios muitas vezes têm a capacidade de modificar, melhorar ou interromper a sinalização de estrogênio através de sua capacidade de agir como ligantes para os receptores de estrogênio intranuclear alfa e beta (ERα e ERβ). Muitos fitoestrogênios têm uma estrutura de anel fenólico semelhante aos estrogênios que lhes permite ligar receptores de estrogênio. Aqueles com atividade estrogênica agonizante funcionam como estrogênio, formando um complexo ativado de ligante ER que pode escurecer e se ligar a um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e desencadear transcrição genética11. Assim, estrogênios e fitoestrogênios regulam a atividade celular e as funções do sistema através de suas ações como fatores de transcrição.
Aqui apresentamos o novo uso de um ensaio baseado em células para triagem de extratos vegetais para a presença de compostos que têm atividade biológica estrogênica. Este ensaio usa células de ovário de hamster chinês projetadas para expressar altamente ERβ, que foram transfectadas com o gene de luciferase de hamster(Photinus pyralis) ligado a um promotor do ERE12. Quando os compostos estrogênicos estão presentes, eles se ligam ao ER, escurecem e se ligam ao ERE, levando à transcrição do gene da luciferase. Após a adição de uma solução de substrato, a luciferase catalisa uma reação que leva à emissão de fótons. Portanto, amostras positivas produzem amostras leves e negativas.
Este ensaio comercialmente disponível elimina a necessidade de laboratórios transfetarem as células mamíferas com o gene repórter e o receptor de estrogênio13,14, que era instável e variável em eficácia. O ensaio fornece uma plataforma de transfecção estável que permite determinar rapidamente e simplesmente se uma planta tem atividade estrogênica através da ligação do receptor.
Testamos a hipótese de que a soja tem maior atividade estrogênica do que todos os outros alimentos, dadas as suas concentrações conhecidas de isoflavonas estrogênicas15 utilizando alimentos humanos de mercearias locais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de repórter ERβ desenvolvido para triagem individual de agentes farmacêuticos também é adequado para triagem de alimentos vegetais para fitoestrogênios biologicamente ativos através do ERβ. Considerações importantes no protocolo incluem tratar as amostras da planta com cuidado: material vegetal fresco precisa ser seco rapidamente para evitar moldagem ou outra degradação biológica, e precisa ser mantido longe da luz para evitar a fotolise dos compostos18. O protocolo de ensaio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Dale Leitman pelo treinamento inicial no uso de ensaios transitórios de transfecção para determinar a atividade estrogênica de alimentos vegetais primatas. Graças a Bradford Westrich e C. Eric Johnson por ajudar a montar equipamentos de laboratório e treinar alunos em métodos de extração. Finalmente, obrigado à Universidade de Indiana por financiar esta pesquisa.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
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