Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay
Summary
Ticari olarak mevcut bir östrojen reseptörü β muhabir testlerini, insan ve insan dışı primat gıdaları östrojenik aktivite için taramak için optimize ettik. Bilinen östrojenik insan gıda soyasının yüksek olduğunu, diğer gıdaların ise hiçbir aktivite göstermediğini göstererek bu tahlilini doğruladık.
Abstract
Bitkiler birçok hayvan için bir besin kaynağıdır ve binlerce kimyasal üretebilirler. Bu bileşiklerden bazıları, endokrin fonksiyon gibi onları tüketen omurgalılardaki fizyolojik süreçleri etkiler. En iyi çalışılan endokrin-aktif fitokimyasallar olan fitoöstrojenler, omurgalı endokrin sistemin hipotalamo-hipofiz gonadal ekseni ile doğrudan etkileşime girer. Burada, östrojenik biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin varlığı için bitki özlerini taramak için hücre tabanlı bir testin yeni kullanımını sunuyoruz. Bu tahlil, östrojen reseptör betasını (ERβ) yüksek oranda ifade etmek için tasarlanmış ve luciferaz geni ile trans enfekte olmuş memeli hücrelerini kullanır. Östrojenik aktiviteye sahip bileşiklere maruz kalmak, hücrelerin ışık üretmesine neden olur. Bu tahlil, biyolojik östrojenik aktiviteyi test etmenin güvenilir ve basit bir yoludur. Geçici transfeksiyon tahlilleri, özellikle kullanım kolaylığı, hücrelerin stabilitesi ve tahlil hassasiyeti üzerinde çeşitli iyileştirmelere sahiptir.
Introduction
Bitkiler birçok hayvan için gerekli bir besin kaynağıdır, hayatta kalma, üreme, büyüme, gelişme ve davranış için kritik öneme sahip kalori ve besin maddeleri sağlar1. Bitkiler, birçoğu kendi büyümeleri, stomatik bakımları ve üremeleri için adaptasyonlar olarak binlerce kimyasal üretir. Bitki ikincil metabolitleri (PSM’ ler) olarak kabul edilen diğer bileşikler, daha az net işlevlere sahiptir, ancak bazıları toksiktir ve muhtemelen otçul ve parazite karşı bir savunma olarak kullanılır (örneğin, alkaloidler, tanenler)2,3. Bu kimyasalların bazıları, hayvanlarda endokrin işleyişi gibi uzun süreli fizyolojik süreçleri etkileme yeteneğine sahiptir, ancak bu endokrin aktif fitokimyasalların omurgalı endokrin sistemle neden etkileşime girdiği hala belirsizdir2,4.
En iyi çalışılan endokrin-aktif fitokimyasallar olan fitoöstrojenler, yapısal ve işlevsel olarak östrojenleri taklit eden, omurgalı endokrin sistemin hipotaomo-hipofiz gonadal ekseni ile doğrudan etkileşime giren polifenolikPSM’lerdir 5. fitoöstrojenlerin insan diyetinde yutulması, bazı kanserlere, kalp hastalıklarına ve menopoz semptomlarına karşı koruma ile ilişkilidir, ancak diğer etkileri doğurganlık problemlerini içerir. Aslında, bu bileşiklerin fizyolojik etkileri 1940’larda koyunlardaki kısırlığın fitoöstrojen bakımından zengin yonca (Trifolium subterrareum)6üzerinde otlatmalarına atfedildiği zaman keşfedilmiştir. Yutildiğinde, fitoöstrojenler hücrelere geçebilir ve östrojenin etkilerini taklit edebilir. Fitoöstrojenlerin koyun doğurganlığı üzerinde olumsuz etkileri olsa da, fitoöstrojenler ve fizyoloji arasındaki ilişki basit değildir. Koyunlar gibi, güney beyaz gergedanları da yüksek miktarlarda soya ve yoncadan elde edilen yemlerdeki östrojenik bileşiklere duyarlılık gösterir. Hamilelik sırasında bu diyeti besleyen kadınların kızlarının üreme olasılığı daha düşüktür7. Bununla birlikte, diğer çalışmalar fitoöstrojenlerin, yaşlı farelerde yumurtalık köklerinin olgunlaşması da dahil olmak üzere olumlu etkileri olabileceğini göstermiştir8, bazı kanserlerin önlenmesi, antioksidan aktivite ve antiproliferatif etkiler9.
Östrojenlerin üreme, gelişme ve üreme ve merkezi sinir sistemlerinin düzenlenmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik işlevleri etkilediği göz önüne alındığında, fitoöstrojenlerin etkilerinin genişliği şaşırtıcı değildir10. Birçok etki mekanizması olmasına rağmen, fitoöstrojenler genellikle intranükleer östrojen reseptörleri alfa ve beta (ERα ve ERβ) için ligand görevi görebilme yetenekleri sayesinde östrojen sinyalini değiştirme, geliştirme veya bozma yeteneğine sahiptir. Birçok fitoöstrojen, östrojen reseptörlerini bağlamalarını sağlayan östrojenlere benzer fenolik bir halka yapısına sahiptir. Östrojen gibi agonistik östrojenik aktivite işlevine sahip olanlar, bir östrojen yanıt elemanına (ERE) küçültebilen ve bağlanabilen ve gen transkripsiyonunu tetikleyebilen aktif bir ER-ligand kompleksi oluşturur11. Böylece östrojenler ve fitoöstrojenler transkripsiyon faktörleri olarak yaptıkları eylemlerle hücre aktivitesini ve sistem fonksiyonlarını düzenlerler.
Burada, östrojenik biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin varlığı için bitki özlerini taramak için hücre tabanlı bir testin yeni kullanımını sunuyoruz. Bu tahlil, ere promotörü12ile bağlantılı ateş böceği (Photinus pyralis) luciferaz geni ile transfekte edilmiş ERβ’yi yüksek oranda ifade etmek için tasarlanmış Çin hamster yumurtalık CHO hücrelerini kullanır. Östrojenik bileşikler mevcut olduğunda, acil servise bağlanırlar, küçülürler ve ERE’ye bağlanırlar, bu da luciferaz geninin transkripsiyonuna yol açtı. Bir substrat çözeltisi eklenmeden sonra, luciferaz foton emisyonuna yol açan bir reaksiyonu katalize eder. Bu nedenle, pozitif numuneler ışık üretir ve negatif numuneler üretmez.
Piyasada bulunan bu tahlil, laboratuvarların memeli hücrelerini muhabir geni ve östrojen reseptörü13,14ile dönüştürme ihtiyacını ortadan kaldırır. Test, bir bitkinin reseptör bağlama yoluyla östrojenik aktiviteye sahip olup olmadığını hızlı ve basit bir şekilde belirlemeye izin veren kararlı bir transfeksiyon platformu sağlar.
Soya fasulyesinin bilinen östrojenik izoflavon15 konsantrasyonları göz önüne alındığında, yerel bakkallardan gelen insan gıdalarını kullanarak diğer tüm gıdalardan daha yüksek östrojenik aktiviteye sahip olduğu hipotezini test ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farmasötik ajanları tek tek taramak için geliştirilen ERβ muhabir testi, ERβ aracılığıyla biyolojik olarak aktif olan fitoöstrojenler için bitkisel gıdaların taranmasını da uygundur. Protokoldeki önemli hususlar arasında bitki örneklerinin özenle ele alınması yer almaktadır: küflenmeyi veya diğer biyolojik bozulmaları önlemek için taze bitki materyalinin hızlı bir şekilde kurutulması ve bileşiklerin fotolizini önlemek için ışıktan uzak tutulması gerekir18. Ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, primat bitki gıdalarının östrojenik aktivitesini belirlemek için geçici transfeksiyon testlerinin kullanımındaki ilk eğitim için Dale Leitman’a minnettardır. Bradford Westrich ve C. Eric Johnson’a laboratuvar ekipmanlarının kurulmasına ve öğrencilerin ekstraksiyon yöntemlerine eğitmelerine yardımcı oldular. Son olarak, bu araştırmayı finanse ettiğiniz için Indiana Üniversitesi’ne teşekkür ederiz.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. . Primate Diet & Nutrition. , (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -. i., et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- . . Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3′-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. . Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. . Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).
