Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay
Summary
Мы оптимизировали коммерчески доступные рецепторы эстрогена β анализа для скрининга человеческих и нечеловеческих продуктов приматов для эстрогенной активности. Мы подтвердили этот анализ, показав, что известные эстрогенные человеческие пищевые сои регистрирует высокий, в то время как другие продукты не показывают никакой активности.
Abstract
Растения являются источником пищи для многих животных, и они могут производить тысячи химических веществ. Некоторые из этих соединений влияют на физиологические процессы у позвоночных, которые потребляют их, такие как эндокринная функция. Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические вещества, непосредственно взаимодействуют с гипоталамо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокринной системы. Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует клетки млекопитающих, разработанные для высокого экспресс-бета рецептора эстрогена (ER) и которые были трансфицированы геном люциферазы. Воздействие соединений с эстрогенной активностью приводит к клеткам, производящим свет. Этот анализ является надежным и простым способом проверки на биологическую эстрогенную активность. Он имеет несколько улучшений по сравнению с переходными анализа трансфекции, прежде всего, простота использования, стабильность клеток, и чувствительность анализа.
Introduction
Растения являются необходимым источником пищи для многих животных, обеспечивая калории и питательные вещества, критически важные для выживания, воспроизводства, роста, развития иповедения 1. Растения производят тысячи химических веществ, многие из которых являются адаптацией для собственного роста, стоматического обслуживания и воспроизводства. Другие соединения, считающихся вторичными метаболитами растений (PSMs), имеют функции, которые менее ясны, хотя некоторые из них токсичны и, вероятно, используются в качестве защиты от травоядного и тунеядства (например, алкалоиды, танины)2,3. Некоторые из этих химических веществ имеют возможность влиять на долгосрочные физиологические процессы у животных, такие как эндокринное функционирование, хотя почему эти эндокринно-активные фитохимические вещества взаимодействуют с эндокринной системой позвоночныхдо сих пор неясно 2,4.
Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические, являются полифенольными ПМС, которые структурно и функционально имитируют эстрогены, непосредственно взаимодействуя с гипоталомо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокриннойсистемы 5. Прием фитоэстрогенов в рационе человека связан с защитой от некоторых видов рака, сердечных заболеваний и симптомов менопаузы, хотя другие эффекты включают проблемы фертильности. В самом деле, физиологические эффекты этих соединений были обнаружены в 1940-х годов, когда бесплодие у овец было связано с их выпаса на фитоэстроген богатых клевера (Trifolium subterrareum)6. При приеме внутрь, фитоэстрогены могут передаваться в клетки и имитировать эффекты эстрогена. Хотя фитоэстрогены негативно сказались на плодовитости овец, взаимосвязь между фитоэстрогенами и физиологией не проста. Как и овцы, южный белый носорог проявляет чувствительность к эстрогенным соединениям в кормах, полученных из большого количества сои и люцерны. Дочери женщин кормили эту диету во время беременности, менее вероятно, воспроизвести7. Тем не менее, другие исследования показали, что фитоэстрогены могут иметь положительный эффект, а также, в том числе созревание фолликуловяичников у пожилых мышей 8, профилактика некоторых видов рака, антиоксидантной активности и антипролиферативныхэффектов 9.
Широта воздействия фитоэстрогенов не удивительно, учитывая, что эстрогены влияют на широкий спектр биологических функций, в том числе роста, развития и регулирования репродуктивной и центральнойнервной систем 10. Хотя Есть много механизмов действия, фитоэстрогены часто имеют возможность изменять, повысить, или нарушить эстроген сигнализации через их способность выступать в качестве лигандов для внутриядерных рецепторов эстрогена альфа и бета (ER и ER). Многие фитоэстрогены имеют фенольные структуры кольца похож на эстрогены, что позволяет им связывать рецепторы эстрогена. Те, с агонистической эстрогенной функции активности, как эстроген, образуя активированный ER-лиганд комплекс, который может затемнить и связываться с эстрогеном ответ элемент (ERE) и вызватьтранскрипцию гена 11. Таким образом, эстрогены и фитоэстрогены регулируют активность клеток и функции системы через их действия в качестве транскрипционных факторов.
Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует китайский хомяк яичников CHO клетки инженерии высоко выразить ER, которые были трансфицированы с светлячок (Photinus pyralis) luciferase ген, связанный спромоутером ERE 12. Когда эстрогенные соединения присутствуют, они связываются с ER, затемняют, и связываются с ERE, что приводит к транскрипции гена люциферазы. При добавлении раствора субстрата люцифераза катализует реакцию, ведущую к фотону. Таким образом, положительные образцы производят легкие и отрицательные образцы нет.
Этот коммерчески доступный анализ устраняет необходимость для лабораторий, чтобы трансфект клеток млекопитающих с геном репортераи рецептором эстрогена 13,14, который был нестабильным и переменной по эффективности. Анализ обеспечивает стабильную платформу трансфекции, которая позволяет быстро и просто определить, имеет ли растение эстрогенную активность через связывание рецепторов.
Мы тестируем гипотезу о том, что соевые бобы имеют более высокую эстрогенную активность, чем все другие продукты, учитывая их известные концентрации эстрогенных изофлавонов15 с использованием человеческих продуктов из местных бакалейных лавок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ репортеров ER, разработанный для индивидуального скрининга фармацевтических агентов, также подходит для скрининга растительных продуктов на фитоэстрогены, биологически активные через ER. Важные соображения в протоколе включают в себя лечение образцов растений с осторожностью: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Дейл Лейтман для первоначальной подготовки в использовании переходных анализов трансфекции для определения эстрогенной активности приматов растительных продуктов. Спасибо Брэдфорду Вестричу и К. Эрику Джонсону за помощь в настройке лабораторного оборудования и обучении студентов методам экстракции. Наконец, спасибо Университету Индианы за финансирование этого исследования.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. . Primate Diet & Nutrition. , (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -. i., et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- . . Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3′-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. . Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. . Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).
