Screening för fytoöstrogener med hjälp av en cellbaserad östrogenreceptor β Reporter Assay
Summary
Vi har optimerat en kommersiellt tillgänglig östrogenreceptor β reporteranalys för screening av mänskliga och icke-mänskliga primatmat för östrogen aktivitet. Vi validerade denna analys genom att visa att den kända östrogena mänskliga mat soja registrerar hög, medan andra livsmedel visar ingen aktivitet.
Abstract
Växter är en källa till mat för många djur, och de kan producera tusentals kemikalier. Vissa av dessa föreningar påverkar fysiologiska processer hos ryggradsdjuren som konsumerar dem, såsom endokrin funktion. Fytoöstrogener, den mest väl studerade endokrina aktiva fytokemikalier, interagerar direkt med hypotalamus-hypofysen gonadal axeln i ryggradsdjur endokrina systemet. Här presenterar vi den nya användningen av en cellbaserad analys för att screena växtextrakt för förekomst av föreningar som har östrogen biologisk aktivitet. Denna analys använder däggdjursceller konstruerade för att mycket uttrycka östrogenreceptor beta (ERβ) och som har transfecterats med en luciferas gen. Exponering för föreningar med östrogen aktivitet resulterar i att cellerna producerar ljus. Denna analys är ett tillförlitligt och enkelt sätt att testa för biologisk östrogen aktivitet. Det har flera förbättringar över övergående transfection analyser, särskilt användarvänlighet, cellernas stabilitet och känsligheten hos analysen.
Introduction
Växter är en nödvändig källa till mat för många djur, vilket ger kalorier och näringsämnen som är kritiska för överlevnad, reproduktion, tillväxt, utveckling och beteende1. Växter producerar tusentals kemikalier, många som anpassningar för sin egen tillväxt, stomatiskt underhåll och reproduktion. Andra föreningar, som anses vara växt sekundära metaboliter (PSM), har funktioner som är mindre tydliga, även om vissa är giftiga och sannolikt används som ett försvar mot växtätande och parasitism (t.ex. alkaloider, tanniner)2,3. Vissa av dessa kemikalier har förmågan att påverka långsiktiga fysiologiska processer hos djur, såsom endokrin funktion, även om varför dessa endokrina aktiva fytokemikalier interagerar med ryggradsdjurens endokrina system är fortfarande oklart2,4.
Fytoöstrogener, de mest väl studerade endokrina aktiva fytokemikalier, är polyfenoliska PSMs som strukturellt och funktionellt efterliknar östrogener, direkt interagerar med hypotalaomo-hypofysen gonadal axeln i ryggradsdjur endokrina systemet5. Intag av fytoöstrogener i den mänskliga kosten är förknippat med skydd mot vissa cancerformer, hjärtsjukdomar och klimakteriebesvär, även om andra effekter inkluderar fertilitetsproblem. Faktum är att de fysiologiska effekterna av dessa föreningar upptäcktes på 1940-talet när infertilitet hos får tillskrevs deras bete på fytoöstrogenrik klöver (Trifolium subterrareum)6. När intas, fytoöstrogener kan passera in i celler och efterlikna effekterna av östrogen. Medan fytoöstrogener hade negativa effekter på fårens fertilitet, är förhållandet mellan fytoöstrogener och fysiologi inte enkelt. Liksom får visar södra vita noshörningar känslighet för östrogena föreningar i foder som härrör från stora mängder soja och alfalfa. Döttrar till kvinnor som matas denna diet under graviditeten är mindre benägna att reproducera7. Andra studier har dock visat att fytoöstrogener också kan ha positiva effekter, inklusive mognad av äggstockssäckar hos äldre möss8, förebyggande av vissa cancerformer, antioxidantaktivitet och antiproliferativa effekter9.
Bredden av effekterna av fytoöstrogener är inte förvånande med tanke på att östrogener påverkar ett brett spektrum av biologiska funktioner, inklusive tillväxt, utveckling, och reglering av de reproduktiva och centrala nervsystemet10. Även om det finns många verkningsmekanismer, fytoöstrogener har ofta förmågan att modifiera, förbättra eller störa östrogen signalering genom sin förmåga att fungera som ligands för de intranukleära östrogenreceptorerna alfa och beta (ERα och ERβ). Många fytoöstrogener har en fenolisk ringstruktur som liknar östrogener som gör det möjligt för dem att binda östrogenreceptorer. De med agonistisk östrogen aktivitet fungerar som östrogen, bildar ett aktiverat ER-ligand komplex som kan dimerize och binda till ett östrogen svar element (ERE) och utlösa gen transkription11. Således reglerar östrogener och fytoöstrogener cellaktivitet och systemfunktioner genom sina handlingar som transkriptionsfaktorer.
Här presenterar vi den nya användningen av en cellbaserad analys för att screena växtextrakt för förekomst av föreningar som har östrogen biologisk aktivitet. Denna analys använder kinesiska hamster äggstock CHO celler konstruerade för att mycket uttrycka ERβ, som har transfected med firefly (Photinus pyralis) luciferase gen kopplad till en ERE promotor12. När östrogena föreningar finns binder de till akuten, dimeriserar och binder till ERE, vilket leder till transkription av luciferasgenen. Vid tillsats av en substratlösning katalyserar luciferasen en reaktion som leder till fotonutsläpp. Därför producerar positiva prover lätta och negativa prover gör det inte.
Denna kommersiellt tillgängliga analys eliminerar behovet av laboratorier att transfekterade däggdjurscellerna med reportergenen och östrogenreceptorn13,14, som var instabil och varierande i effekt. Analysen ger en stabil transfection plattform som möjliggör snabbt och enkelt avgöra om en växt har östrogen aktivitet via receptorbindning.
Vi testar hypotesen att sojabönor har högre östrogen aktivitet än alla andra livsmedel med tanke på deras kända koncentrationer av östrogena isoflavoner15 med humana livsmedel från lokala livsmedelsbutiker.
Protocol
Representative Results
Discussion
ERβ-reporterns analys som utvecklats för att individuellt screena farmaceutiska medel är också lämplig för screening av vegetabiliska livsmedel för fytoöstrogener som är biologiskt aktiva genom ERβ. Viktiga överväganden i protokollet inkluderar behandling av växtproverna med försiktighet: färskt växtmaterial måste torkas snabbt för att förhindra gjutning eller annan biologisk nedbrytning, och det måste hållas borta från ljus för att förhindra fotolys avföreningarna 18. Det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma mot Dale Leitman för inledande utbildning i användning av transienta transfection analyser för att bestämma östrogen aktivitet av primat vegetabiliska livsmedel. Tack till Bradford Westrich och C. Eric Johnson för att de hjälpte till att sätta upp laboratorieutrustning och utbilda studenter i extraktionsmetoder. Slutligen, tack till Indiana University för att ni finansierar denna forskning.
Materials
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ℃ water bath | |||
| 37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. . Primate Diet & Nutrition. , (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -. i., et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- . . Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3′-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. . Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. . Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).
