Dobbelt i Utero elektroporation til target temporally og rumligt adskilte cellepopulationer
Summary
Dobbelt i livmoderen elektroporation tillader målretning cellepopulationer, der er rumligt og tidsmæssigt adskilt. Denne teknik er nyttig til at visualisere interaktioner mellem disse cellepopulationer ved hjælp af fluorescerende proteiner under normale forhold, men også efter funktionelle eksperimenter for at forstyrre gener af interesse.
Abstract
In utero elektroporation er en in vivo DNA overførsel teknik flittigt anvendes til at studere de molekylære og cellulære mekanismer underliggende pattedyr corticogenesis. Denne procedure udnytter hjernen hjertekamrene til at tillade indførelsen af DNA af interesse og bruger et par elektroder til direkte indgangen af det genetiske materiale i cellerne foring ventrikel, de neurale stamceller. Denne metode gør det muligt for forskere at mærke de ønskede celler og/ eller manipulere udtryk for gener af interesse i disse celler. Det har flere applikationer, herunder analyser rettet mod neuronal migration, afstamning sporing, og axonal pathfinding. Et vigtigt træk ved denne metode er dens tidsmæssige og regionale kontrol, der muliggør omgåelse af potentielle problemer i forbindelse med fosterdægalitet eller manglen på specifikke CRE-førermus. Et andet relevant aspekt af denne teknik er, at det bidrager til at reducere de økonomiske og tidsmæssige begrænsninger, der involverer generering af nye muselinjer, som bliver særligt vigtige i studiet af interaktioner mellem celletyper, der stammer fra fjerne områder af hjernen i forskellige udviklingsaltidsaldre. Her beskriver vi en dobbelt elektroporationstrategi, der gør det muligt at målrette mod cellepopulationer, der er rumligt og tidsmæssigt adskilte. Med denne tilgang kan vi mærke forskellige undertyper af celler på forskellige steder med udvalgte fluorescerende proteiner for at visualisere dem, og / eller vi kan manipulere gener af interesse udtrykt af disse forskellige celler på de rette tidspunkter. Denne strategi øger potentialet i in utero elektroporation og giver et kraftfuldt værktøj til at studere adfærd tidsmæssigt og rumligt adskilte cellepopulationer, der migrerer for at etablere tætte kontakter, samt langtrækkende interaktioner gennem axonale fremskrivninger, reducere tidsmæssige og økonomiske omkostninger.
Introduction
Hjernebarken er en meget kompleks og indviklet organiseret struktur. For at opnå en sådan grad af organisation, kortikale projektion neuroner gå gennem komplekse udviklingsprocesser, der kræver deres tidsmæssige generation, migration til deres endelige destination i kortikale plade, og etablering af kort-og langtrækkende forbindelser1,2. I lang tid var den klassiske måde at studere korticogenese baseret på brugen af knockout eller knock-in murine modeller af gener af interesse. Men denne strategi, og især brugen af betingede knockout mus, er tidskrævende og dyrt, og nogle gange giver yderligere problemer med hensyn til eksistensen af genetisk redundans eller manglen på specifikke CRE drivere, blandt andre spørgsmål. En af de metoder , der opstod for at forsøge at løse disse problemer , og som i dag i vid stor grad anvendes til at studere kortikal udvikling er in utero elektroporation3,4. I utero elektroporation er en teknik, der anvendes til somatiske transgenese, så in vivo målretning af neurale stamceller og deres afkom. Denne metode kan anvendes til at mærke celler ved at udtrykke fluorescerende proteiner5,6, til genmanipulation in vivo (dvs. gevinst eller tab af funktionsanalyser)7,8,9, til isolerende elektroporerede cortices in vitro og dyrkning af celler8,10. Desuden tillader elektroporation i livmoderen tidsmæssig og regional kontrol af målområdet. Denne teknik har mange applikationer og har været meget anvendt til at studere neuronal migration, stamcelledeling, neuronal konnektivitet, og andre emner8,,9,,11,,12.
Det nuværende manuskript beskriver brugen af en in utero elektroporation variant, kaldet dobbelt i livmoderen elektroporation, at analysere samspillet mellem celler i hjernebarken med forskellige tidsmæssige og rumlige oprindelse. Disse undersøgelser er yderst komplekse at gennemføre, når der anvendes murine modeller, fordi de kræver kombineret brug af flere transgene linjer. Nogle af anvendelserne af protokollen, der er beskrevet i dette papir omfatter undersøgelse af tætte interaktioner mellem tilstødende celler, samt interaktioner mellem fjerne celler gennem langtrækkende fremskrivninger. Metoden kræver udførelse af to uafhængige in utero elektroporation operationer, adskilt tidsmæssigt og rumligt, på de samme embryoner til at målrette forskellige cellepopulationer af interesse. Fordelen ved denne tilgang er muligheden for at manipulere genfunktion i den ene eller begge typer af neuroner ved hjælp af vilde type dyr. Desuden kan disse funktionelle eksperimenter kombineres med ekspression af cytoplasmatiske eller membranmærkede fluorescerende proteiner for at visualisere den fine morfologi af målrettede celler, herunder dendritter og axoner, og analysere mulige forskelle i cellulære interaktioner i forhold til en kontrol (dvs. celler kun mærket med fluorescerende protein).
Protokollen afgrænset her er fokuseret på studiet af cellulære interaktioner inde i neocortex, men denne strategi kan også bruges til at undersøge interaktioner med ekstrakortikale områder, der kan målrettes ved hjælp af utero elektroporation, ligesom subpallium eller thalamus13,14, eller celle-celle interaktioner i andre strukturer, ligesom cerebellum15. Målretning af forskellige områder er baseret på retningen af elektroderne og på ventrikel, hvor DNA injiceres (lateral, tredje eller fjerde). Med den strategi, der er beskrevet her, kan vi mærke et betydeligt antal celler, hvilket er nyttigt til at evaluere generelle ændringer i konnektivitet / innervation i funktionelle eksperimenter. Ikke desto mindre, at studere fine ændringer i tilslutningsmuligheder, kan man bruge modificerede versioner af in utero elektroporation at få sparser mærkning og identificere enkelte celler16. Sammenfattende er dobbelt i livmoderen elektroporation en alsidig metode, der gør det muligt at målrette tidsmæssigt og rumligt adskilte cellepopulationer og studere deres interaktioner i detaljer, enten i kontrolforhold eller kombineret med funktionelle eksperimenter, hvilket reducerer tidsmæssige og økonomiske omkostninger betydeligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet af celle-celle interaktioner in vivo i regioner med høj cellulær tæthed som hjernebarken er en kompleks opgave. Traditionelle tilgange, herunder anvendelse af antistoffer til mærkning af neuritter, er ikke egnede på grund af manglen på specifikke markører for forskellige cellepopulationer. Brugen af transgene murine modeller, hvor en bestemt celletype udtrykker et fluorescerende protein, er nyttigt at visualisere de neuronale processer, men dette afhænger af tilgængeligheden af sådanne modeller. Denne o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Cristina Andrés Carbonell og medlemmer af Animal Care-faciliteten i Universidad de Valencia for teknisk bistand. Vi vil også gerne takke Isabel Fariñas og Sacramento R. Ferrón for reagenser og dele deres udstyr med os. I.M.W er finansieret af en Garantía Juvenil kontrakt fra Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D er finansieret af Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz har et Ramón y Cajal-legat (RYC-2015-19058) fra den spanske ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dette arbejde blev finansieret RYC-2015-19058 og SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
