כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות
Summary
כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.
Abstract
באלקטרופורציה הרחם היא בטכניקת העברת ה-DNA vivo שימוש נרחב כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים והסלולריים הבסיסיים corticogenesis. הליך זה מנצל את חללי המוח כדי לאפשר את המבוא של ה-DNA של עניין ומשתמש בזוג אלקטרודות כדי לכוון את הכניסה של החומר הגנטי לתוך התאים רירית החדר, תאי גזע עצביים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לתייג את התאים הרצויים ו/או לטפל בביטוי של גנים המעניינים בתאים אלה. יש לו מספר יישומים, כולל מיקוד העברת הגירה עצבית, מעקב אחר שושלת היוחסין, ומציאת האקונאליות. תכונה חשובה של שיטה זו היא בקרה הזמני והאזורי שלה, המאפשר לעקוף את הבעיות הפוטנציאליות הקשורות השפעה עובריים או העדר עכברים ספציפיים מנהל התקן. היבט רלוונטי נוסף של טכניקה זו הוא שהוא מסייע לצמצם במידה ניכרת את המגבלות הכלכליות והטמפורלית הכרוכות ביצירת קווי עכבר חדשים, הנעשים חשובים במיוחד בחקר האינטראקציות בין סוגי התאים הנובעים מאזורים רחוקים במוח בגילאים התפתחותיים שונים. כאן אנו מתארים אסטרטגיית אלקטרופורציה כפולה המאפשרת פילוח של אוכלוסיות תאים המופרדות באופן זמני ומופרדות. עם גישה זו אנו יכולים לתייג תת סוגים שונים של תאים במיקומים שונים עם חלבונים שנבחרו הפלורסנט כדי להמחיש אותם, ו/או אנחנו יכולים לטפל בגנים של ריבית המתבטאת על ידי אלה תאים שונים בזמנים המתאימים. אסטרטגיה זו מגבירה את הפוטנציאל באלקטרופורציה של הרחם ומספקת כלי רב-עוצמה לחקר ההתנהגות של אוכלוסיות תאים המופרדות באופן זמני ומופרדות, העוברות להקמת קשרים קרובים, כמו גם אינטראקציות ארוכות טווח באמצעות התחזיות האקאליות, הפחתת עלויות זמניות וכלכליות.
Introduction
קליפת המוח היא מבנה מורכב ומסודר מאוד. כדי להשיג מידה כזו של ארגון, נוירונים הקרנה בקליפת הגוף לעבור תהליכים התפתחותיים מורכבים הדורשים הדור הזמני שלהם, הגירה היעד הסופי שלהם לוחית הקליפה, והקמת חיבורים קצרים וארוכי טווח1,2. במשך זמן רב, הדרך הקלאסית ללמוד corticogenesis היה מבוסס על השימוש בנוקאאוט או מודלים מורטין של גנים של עניין. עם זאת, אסטרטגיה זו, ובעיקר השימוש בעכברים מותנים מותנה, הוא זמן רב ויקר, ולפעמים מציג בעיות נוספות לגבי קיומו של יתירות גנטית או היעדר מנהלי התקנים מסוימים של היצור, בין היתר. אחת הגישות שהתעוררו לנסות לטפל בבעיות אלה וכיום משמש באופן נרחב לחקר ההתפתחות הקורטיקלית היא בתוך הרחם3,4. באלקטרופורציה של הרחם היא טכניקה המשמשת לטרנסגנזה סומטית, המאפשרת התמקדות בvivo של תאי גזע עצביים וצאצהם. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לתייג תאים לפי ביטוי של חלבונים פלואורסצנטי5,6, עבור מניפולציה גנים ב vivo (כלומר, להרוויח או לאבד את הפונקציה assays)7,8,9, עבור בידוד אלקטרופורציה ממגורות בתאי מבחנה ו-culturing תאים8,10. יתר על כן, באמצעות אלקטרופורציה הרחם מאפשר בקרה הזמני והאזורי של האזור המיועד. טכניקה זו כוללת יישומים רבים ושימש רבות לחקר הגירה עצבית, חטיבת תאי גזע, קישוריות עצבית, ונושאים אחרים8,9,11,12.
כתב היד הנוכחי מתאר את השימוש במשתנה אלקטרופורציה של הרחם, הנקרא כפול באמצעות אלקטרופורציה של הרחם, כדי לנתח את האינטראקציות של תאים בקליפת המוח עם מקורות הזמן והמרחב השונים. מחקרים אלה הם מורכבים מאוד להשלים בעת העסקת מודלים murine כי הם דורשים שימוש משולב של מספר קווים טרנסגניים. חלק מהיישומים של הפרוטוקול המתואר במאמר זה כוללים את חקר האינטראקציות הקרובות בין התאים השכנים, כמו גם אינטראקציות בין תאים מרוחקים באמצעות תחזיות טווח ארוך. השיטה מחייבת ביצוע שני באופן עצמאי ניתוחי אלקטרופורציה ברחם, מופרדים באופן זמני ובצורה מהותית, על אותם עוברים למקד אוכלוסיות תאים שונות של עניין. היתרון של גישה זו הוא האפשרות של מניפולציה הפונקציה גנים באחד או בשני סוגים של נוירונים באמצעות חיות טיפוס פראי. בנוסף, ניסויים פונקציונליים אלה ניתן לשלב עם הביטוי של cytoplasmic או ממברנה מתויג חלבונים פלורסנט כדי להמחיש את המבנה המשובח של תאים ממוקדים, כולל דנדריטים ואקסונים, ולנתח הבדלים אפשריים אינטראקציה תאית בהשוואה עם פקד (כלומר, תאים המסומנים רק עם חלבון פלורסנט).
הפרוטוקול הנמצא כאן מתמקד בחקר האינטראקציות הסלולריות בתוך הקליפת המוח, אך ניתן להשתמש באסטרטגיה זו גם כדי לבחון אינטראקציות עם אזורים בעלי מוצא שיכולים להיות ממוקדים באמצעות אלקטרופורציה של הרחם, כגון תת-התלמוס או האינטראקציות של13,14או תאי תא במבנים אחרים, כגון המוח15. פילוח של אזורים שונים מבוסס על כיוון האלקטרודות ועל החדר שבו ה-DNA מוזרק (לרוחב, שלישי, או הרביעי). עם האסטרטגיה המתוארת כאן, אנו יכולים לתייג מספר משמעותי של תאים, אשר שימושי כדי להעריך שינויים כלליים בקישוריות/אינבציה בניסויים פונקציונליים. למרות זאת, כדי ללמוד שינויים עדינים בקישוריות, ניתן להשתמש בגרסאות ששונו של אלקטרופורציה ברחם כדי לקבל תיוג מספרנות ולזהות תאים בודדים16. לסיכום, כפול באמצעות אלקטרופורציה הרחם היא שיטה רב-תכליתית המאפשרת מיקוד באופן זמני והפרדה בין אוכלוסיות תאים ולימוד האינטראקציות שלהם בפירוט, בתנאי שליטה או בשילוב עם ניסויים פונקציונליים, צמצום משמעותי עלויות הזמני והכלכלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר של אינטראקציות תא תא בvivo באזורים עם צפיפות תאית גבוהה כמו קליפת המוח היא משימה מורכבת. גישות מסורתיות כולל שימוש בנוגדנים לתווית neurites אינם מתאימים בגלל העדר סמנים ספציפיים עבור אוכלוסיות תאים שונות. השימוש במודלים מורגניים, כאשר סוג תא מסוים מבטא חלבון פלורסנט, הוא שימושי להמחיש את …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לכריסטינה אנדרס קרבונל ולחברי המכון לטיפול בבעלי חיים באוניברסידה ולנסיה לקבלת סיוע טכני. כמו כן, אנו רוצים להודות לאיזבל פריניאס ולסקרמנטו ר. פריון לריאגנטים ולשיתוף הציוד שלהם איתנו. אני ממומן על ידי חוזה Juvenil Garantía מתוך Conselleria דה ולנסיה (GJIDI/2018/A/221), D. dA ממומן על ידי Ministerio de Ciencia, חדשנות האוניברסיטה (MICINN) (FPI-PRE2018 086150). ג. גיל-צאנז מחזיק רמון מגרנט (RYC-2015-19058) מ Ministerio de Ciencia הספרדי, האוניברסיטה האנגלית (MICINN). עבודה זו ממומנת RYC-2015-19058 ו-SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
