자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다
Summary
자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.
Abstract
자궁에서 전기화는 포유류 코르티코발생의 근본적인 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되는 생체 내 DNA 전달 기술이다. 이 절차는 관심있는 DNA의 도입을 허용하기 위해 뇌 심실을 활용하고 심실, 신경 줄기 세포를 안대기 세포로 유전 물질의 입구를 지시하기 위해 전극의 쌍을 사용합니다. 이 방법은 연구원이 원하는 세포를 표지하고/또는 그 세포에 있는 관심있는 유전자의 발현을 조작하는 것을 허용합니다. 그것은 여러 응용 프로그램이, 신경 마이그레이션을 대상으로 하는 애서를 포함 하 여, 혈통 추적, 그리고 축 하 경로 찾는. 이 방법의 중요한 특징은 배아 치사 또는 특정 CRE 드라이버 마우스의 부족과 관련된 잠재적 인 문제의 우회를 허용, 그것의 시간 적 및 지역 제어입니다. 이 기술의 또 다른 관련 측면은 다른 발달 나이에 두뇌의 먼 지역에서 유래하는 세포 모형 사이 상호 작용의 연구 결과에서 특히 중요하게 되는 새로운 마우스 선의 생성을 관련시키는 경제 및 측두적인 한계를 상당히 감소시키는 것을 돕습니다. 여기서우리는 공간적으로 그리고 현세적으로 분리되는 세포 집단의 타겟팅을 가능하게 하는 이중 전기화 전략을 설명합니다. 이 접근법으로 우리는 선택된 형광 단백질을 가진 다른 위치에 있는 세포의 다른 특수형을 그(것)들을 시각화하기 위하여, 및/또는 우리는 적당한 시간에 이 다른 세포에 의해 표현된 관심의 유전자를 조작할 수 있습니다. 이 전략은 자궁 전기화의 잠재력을 향상시키고 가까운 접촉을 확립하기 위해 이동하는 시간적이고 공간적으로 분리 된 세포 집단의 행동과 축축한 예측을 통한 장거리 상호 작용의 행동을 연구하여 시간적 및 경제적 비용을 줄이는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
대뇌 피질은 매우 복잡하고 복잡하게 구성된 구조입니다. 이러한 정도의 조직을 달성하기 위해, 피질 프로젝션 뉴런은 측두생성을 필요로 하는 복잡한 발달 과정을 거치며, 피질 판의 최종 목적지로의 마이그레이션, 단거리 및 장거리 연결1,,2의확립을 통해 진행된다. 오랜 시간 동안, 코르티코 발생을 연구하는 고전적인 방법은 관심의 유전자의 녹아웃 또는 노크 에 뮤린 모델의 사용에 기초했다. 그러나, 이 전략, 특히 조건부 녹아웃 마우스의 사용은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 때로는 유전 적 중복의 존재 또는 특정 CRE 드라이버의 부족에 관한 추가 문제를 제시합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 발생 하는 접근 중 하나는 그 피 질 개발을 연구 하기 위해 요즘 광범위 하 게 사용 된다3,,4. 자궁 에서 전기 화는 신경 줄기 세포와 그들의 자손의 생체 표적을 허용, 체세포 전염에 사용되는 기술이다. 본 방법은 형광 단백질55, 6,6생체 내 유전자 조작을 위해 세포를 라벨링하는 데 사용할 수 있다 (즉, 기능 분석의 이득 또는 손실)7,,8,,9,시험관 내의 전기 폴화 코르티스를 분리하고 세포8,,10을배양하는 데 사용할 수 있다. 더욱이, 자궁 전기기화는 표적 영역의 시간적 및 지역 적 제어를 허용한다. 이 기술은 수많은 응용 프로그램을 가지고 널리 뉴런 마이그레이션을 연구하는 데 사용되어왔다, 줄기 세포 분열, 신경 연결, 및 기타 과목8,,9,,11,,12.
현재 원고는 자궁 전기 기형에서 이중이라고 불리는 자궁 전기 기형의 사용을 설명하며, 대뇌 피질에서 세포의 상호 작용을 서로 다른 측두및 공간 기원으로 분석합니다. 이러한 연구는 여러 형질 전환선의 결합 된 사용을 필요로하기 때문에 뮤린 모델을 사용할 때 완료하는 것은 매우 복잡합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜의 응용 프로그램 중 일부는 이웃 세포 간의 긴밀한 상호 작용의 연구뿐만 아니라 장거리 투영을 통해 먼 세포 사이의 상호 작용을 포함한다. 이 방법은 관심의 다른 세포 집단을 표적으로 하기 위하여 동일한 배아에, 측면및 공간적으로 분리된 자궁 전기기 수술에서 2개의 독립적인 능력을 발휘하는 것을 요구합니다. 이 접근법의 장점은 야생 형 동물을 사용하여 뉴런의 하나 또는 둘 다 모형에서 유전자 기능을 조작의 가능성입니다. 또한, 이러한 기능적 실험은 심토플라스믹 또는 멤브레인 태그형 형광 단백질의 발현과 결합하여 물병막 및 축축을 포함한 표적 세포의 미세한 형태를 시각화하고, 대조군(즉, 형광 단백질로만 표지된 세포)과 비교하여 세포 상호 작용의 가능한 차이를 분석할 수 있다.
여기서 묘사된 프로토콜은 신피질 내부의 세포 상호 작용연구에 초점을 맞추고 있지만, 이 전략은 또한 소반15와같은 다른 구조물에서 피판또는 시상13,,14,또는 세포 세포 상호 작용과 같은 자궁 전기포레이션에서 표적화될 수 있는 외피 영역과의 상호 작용을 검사하는 데 사용될 수 있다. 다른 영역의 표적화는 전극의 방향과 DNA가 주입되는 심실 (측면, 세 번째 또는 네 번째)에 기초한다. 여기에 설명된 전략으로, 우리는 기능 실험에서 연결 / 내면의 일반적인 변화를 평가하는 데 유용한 셀의 상당수를 레이블수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 연결의 미세한 변화를 연구하기 위해, 하나는 스파저 라벨링을 얻고 단일세포(16)를식별하기 위해 자궁 전기화에서 수정된 버전을 사용할 수 있다. 요약하자면, 자궁 전기기의 이중은 일시적이고 공간적으로 분리된 세포 집단을 표적으로 하고 통제 조건에서 또는 기능 실험과 결합하여 현세및 경제적 비용을 상당히 줄이는 다목적 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대뇌 피질 같이 높은 세포 밀도를 가진 지구에 있는 세포 세포 상호 작용의 연구 결과는 복잡한 작업입니다. 중성염을 표지하기 위해 항체의 사용을 포함하는 전통적인 접근은 다른 세포 집단을 위한 특정 마커의 부족 때문에 적합하지 않습니다. 특정 세포 유형이 형광성 단백질을 표현하는 형질 전환 기 의 뮤린 모델의 사용은 뉴런 프로세스를 시각화하는 데 유용하지만, 이것은 그러한 모델의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 크리스티나 안드레스 카보넬과 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 관리 시설 회원들에게 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 시약과 우리와 함께 장비를 공유 이사벨 파리냐스와 새크라멘토 R. 페론에 감사드립니다. I.M.W는 콘셀러티아 드 에두카시온 드 발렌시아 (GJIDI/2018/A/221)의 가란시아 주베닐 계약에 의해 지원되며, D.dA.D는 장관 드 시엔시아, 이유니베르시다데스(MICINN) (FPI-PRE2018-08)의 자금을 지원받습니다. C.Gil-Sanz는 스페인 장관 인 이엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스 (MICINN)에서 라몬 y 카잘 그랜트 (RYC-2015-19058)를 보유하고 있습니다. 이 작품은 RYC-2015-19058 및 SAF2017-82880-R (MICINN)에 자금을 지원했습니다.
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
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