Summary

Двойной в утробе электропорации для целевой временно и пространственно отделенных популяций клеток

Published: June 14, 2020
doi:

Summary

Двойная электропорация матки позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. Этот метод полезен для визуализации взаимодействий между этими популяциями клеток с использованием флуоресцентных белков в нормальных условиях, но и после функциональных экспериментов, чтобы возмутить гены, представляющие интерес.

Abstract

В утробе электропорации in vivo метод передачи ДНК широко используется для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе кортикогенеза млекопитающих. Эта процедура использует желудочки мозга, чтобы позволить введение ДНК интерес и использует пару электродов, чтобы направить вход генетического материала в клетки, выстилающие желудочек, нервные стволовые клетки. Этот метод позволяет исследователям маркировать желаемые клетки и/или манипулировать выражением генов, представляющих интерес в этих клетках. Он имеет несколько приложений, в том числе анализы, ориентированные на миграцию нейронов, отслеживание линий и аксональный поиск путей. Важной особенностью этого метода является его временный и региональный контроль, позволяющий обойти потенциальные проблемы, связанные с эмбриональной летальностью или отсутствием конкретных мышей-водителей CRE. Другим важным аспектом этого метода является то, что он помогает значительно уменьшить экономические и временные ограничения, которые связаны с генерацией новых линий мыши, которые становятся особенно важными в изучении взаимодействий между типами клеток, которые возникают в отдаленных областях мозга в разном возрасте развития. Здесь мы описываем стратегию двойного электропорации, которая позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. При таком подходе мы можем маркировать различные подтипы клеток в разных местах с выбранными флуоресцентными белками, чтобы визуализировать их, и/или мы можем манипулировать генами, представляющими интерес, выраженными этими различными клетками в надлежащее время. Эта стратегия повышает потенциал в электропорации матки и обеспечивает мощный инструмент для изучения поведения временно и пространственно разделенных популяций клеток, которые мигрируют для установления тесных контактов, а также дальнобойных взаимодействий через аксональные прогнозы, снижая временные и экономические издержки.

Introduction

Кора головного мозга является очень сложной и замысловато организованной структурой. Для достижения такой степени организации, корковые проекционные нейроны проходят через сложные процессы развития, которые требуют их временного поколения, миграции к конечному пункту назначения в корковой пластине, и создания коротких и дальних соединений1,2. Долгое время классический способ изучения кортикогенеза основывался на использовании нокаут-или стук-в мурин модели генов, представляющих интерес. Тем не менее, эта стратегия, и в частности использование условного нокаут мышей, занимает много времени и дорого, а иногда и создает дополнительные проблемы, связанные с существованием генетической избыточности или отсутствие конкретных драйверов CRE, среди других вопросов. Один из подходов, которые возникли, чтобы попытаться решить эти проблемы, и что в настоящее время широко используется для изучения коркового развития в утробеэлектропорации 3,4. В утробе электропорации является метод, используемый для соматического трансгенеза, что позволяет in vivo ориентации нервных стволовых клеток и их потомства. Этот метод может быть использован для обозначения клеток по выражению флуоресцентных белков5,,6, для манипуляции генами in vivo (т.е. получить или потерю функциональных анализов)7,8,9, для изоляции электропорированных кортиков в пробирке и культивирования клеток8,10., Кроме того, в утробе электропорации допускается временное и региональное управление целевым районом. Этот метод имеет многочисленные применения и широко используется для изучения нейронной миграции, деления стволовых клеток, нейронной связи, и другие предметы8,9,11,12.

Нынешняя рукопись описывает использование в утробе электропорации вариант, называется двойной в утробе электропорации, для анализа взаимодействий клеток в коре головного мозга с различными височных и пространственных происхождения. Эти исследования чрезвычайно сложны для завершения при использовании моделей мурина, поскольку они требуют комбинированного использования нескольких трансгенных линий. Некоторые из применений протокола, описанного в настоящем документе, включают изучение тесных взаимодействий между соседними клетками, а также взаимодействия между удаленными клетками через долгосрочные проекции. Метод требует выполнения двух независимых в утробе электропорации операций, разделенных временно и пространственно, на одних и тех же эмбрионов для целевой различных групп клеток, представляющих интерес. Преимуществом такого подхода является возможность манипулирования функцией генов в одном или обоих типах нейронов с использованием диких животных типа. Кроме того, эти функциональные эксперименты могут быть объединены с выражением цитоплазматических или мембранных флуоресцентных белков для визуализации тонкой морфологии целевых клеток, включая дендритов и аксонов, и анализировать возможные различия в клеточных взаимодействиях по сравнению с контролем (т.е. клетки, помеченные только флуоресцентным белком).

Протокол, очерченный здесь, сосредоточен на изучении клеточных взаимодействий внутри неокортекса, но эта стратегия может также быть использована для изучения взаимодействий с внекортикальными областями, которые могут быть направлены с помощью электропорации внутриутробности, как подпаллий или таламус13,,14, или клеточно-клеточных взаимодействий в других структурах, таких как мозжечок15. Ориентация на различные области основана на ориентации электродов и на желудочке, где впрыскивается ДНК (боковая, третья или четвертая). При описанной здесь стратегии мы можем обозначить значительное количество ячеек, что полезно для оценки общих изменений в подключении/иннервации в функциональных экспериментах. Тем не менее, для изучения мелких изменений в подключении, можно использовать модифицированные версии в электропорации матки, чтобы получить разреженную маркировку и определить одиночные клетки16. Таким образом, двойное в утробе электропорации является универсальным методом, который позволяет ориентации временно и пространственно разделенных популяций клеток и изучение их взаимодействия в деталях, либо в условиях контроля или в сочетании с функциональными экспериментами, значительно снижая временные и экономические затраты.

Protocol

Описанная в настоящем чиновническом процедура была одобрена комитетом по этике, отвечающим за эксперименты, благополучие животных Университета Валенсии и Конселлерии де Агрикультура, Десарролло Сельские, Чрезвычайные Климатика и Transici’n Ecol’gica Из Comunidad Валенсиана, и придерживается руко…

Representative Results

Взаимодействие между соседними клетками возникло в дистальных местах и в разное время: клетки Cajal-Retzius (CR-клетки) и ранние мигрирующие корковые проекционные нейроны (стратегия А) Взаимодействие CR-клеток и ранних корковой проекции нейронов ранее было описано как ?…

Discussion

Изучение клеточно-клеточных взаимодействий в виво в регионах с высокой клеточной плотностью, как кора головного мозга является сложной задачей. Традиционные подходы, включая использование антител для обозначения нейритов, не подходят из-за отсутствия специфических маркеров для разл?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Кристину Андрес Карбонелл и сотрудников центра по уходу за животными Университета Валенсии за техническую помощь. Мы также хотим поблагодарить Изабель Фариньяс и Сакраменто Р. Феррон за реагенты и обмен их оборудованием с нами. I.M.W финансируется за счет контракта Гарантии Джувениля от Консорциума де Эдуказон де Валенсия (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D финансируется Министерством де Сьенсия, Innovaci’n y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). К.Гиль-Санс имеет Рамон и Каджал Грант (RYC-2015-19058) от испанского Ministerio de Ciencia, Innovaci’n y Universidades (MICINN). Эта работа была профинансирована RYC-2015-19058 и SAF2017-82880-R (MICINN).

Materials

Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-25G
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177-5EA
Baby-mixter hemostat (perfusion) Fine Science Tools (FST) 13013-14
Borosilicate glass capillary WPI 1B100-6
Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) Rb Pharmaceuticals Limited 921425
CAG-BFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-EGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mCherry plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
Confocal microscope Olympus FV10i
Cotton Swabs BFHCVDF
Cyanoacrylate glue B. Braun Surgical 1050044
Dissecting scope Zeiss stemi 305
Dumont Forceps #5 Fine Forceps Fine Science Tools (FST) 11254-20
ECM830 Square Wave Electroporator BTX 45-0052
Electric Razor Oster 76998
Endotoxin-free TE buffer QIAGEN 1018499
Ethanol wipes BFHCVDF
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools (FST) 11150-10
Eye ointment Alcon 682542.6
Fast Green dye Sigma-Aldrich F7252-5G
Fine Scissors Fine Science Tools (FST) 14069-09
Fluorescence LEDs CoolLED pE-300-W
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 3143422001
Halsted-Mosquito Hemostats (suture) Fine Science Tools (FST) 91308-12
Heating Pad UFESA AL5514
Inverted epifluorescence microscope Nikon Eclipse TE2000-S
Iodine wipes Lorsoul
Isofluorane vaporizer Flow-Meter A15B5001
Isoflurane Karizoo 586259
Ketamine (Anastemine) Fatro Ibérica SL 583889-2
Kimtech precision wipes Kimberly-Clark 7252
LB (Lennox) Agar GEN Labkem AGLB-00P-500
LB (Lennox) broth GEN Labkem LBBR-00P-500
Low-melting point agarose Fisher Scientific BP165-25
Medetomidine (Sedator) Dechra 573749.2
Microscope coverslips Menel-Gläser 15747592
Microscope Slides Labbox SLIB-F10-050
Mounting medium Electron Microscopy Sciences 17984-25
Mutiwell plates (24) SPL Life Sciences 32024
Mutiwell plates (48) SPL Life Sciences 32048
NaCl (for saline solution) Fisher Scientific 10112640
Needle 25 G (BD Microlance 3) Becton, Dickinson and Company 300600
Orbital incubator S150 Stuart Scientific 5133
P Selecta Incubator J. P. Selecta, s.a. 0485472
Paraformaldehyde PanReac AppliedChem A3813
Penicillin-Streptomycin Sigma -Aldrich P4333
Peristaltic perfusion pump Cole-Parmer EW-07522-30
Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter Btx 45-0489
Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 AgnThos 203-1000
Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm AgnThos 204-1000
Ring Forceps Fine Science Tools (FST) 11103-09
Sodium azide PanReac AppliedChem 122712-1608
Surgical absorbent pad (steryle) HK Surgical PD-M
Suture (Surgicryl PGA 6-0) SMI Suture Materials BYD11071512
Syringe 1ml (BD plastipak) Becton, Dickinson and Company 303172
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Falcon 353003
Vertical Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-30
Vertical microscope Nikon Eclipse Ni
Vibratome Leica VT1200S

References

  1. Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
  2. Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
  7. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  8. Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
  9. Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
  10. Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
  11. Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
  12. Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
  13. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
  14. Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
  15. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
  16. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
  17. Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
  18. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
  19. Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
  20. Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
  21. Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
  22. Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
  23. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
  24. Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
  25. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
  26. Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
  27. Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
  28. DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
  29. Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).

Play Video

Cite This Article
Mateos-White, I., Fabra-Beser, J., de Agustín-Durán, D., Gil-Sanz, C. Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations. J. Vis. Exp. (160), e61046, doi:10.3791/61046 (2020).

View Video