時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重
Summary
子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。
Abstract
子宮内エレクトロポレーションは、哺乳類のコルチコ形成の根底にある分子および細胞機構を研究するために広く使用されるin vivo DNA伝達技術である。この手順は、脳室を利用して目的のDNAの導入を可能にし、一対の電極を使用して、遺伝物質の入り口を心室、神経幹細胞を裏打ちする細胞に向ける。この方法により、研究者は望ましい細胞にラベルを付けたり、それらの細胞に関心のある遺伝子の発現を操作することができます。それは神経移動を標的とするアッセイ、系統の追跡および軸索経路の発見を含む複数の適用を、備えている。この方法の重要な特徴は、その時間的および地域的制御であり、胚致死性または特定のCREドライバーマウスの欠如に関連する潜在的な問題の回避を可能にする。この技術のもう一つの関連する側面は、新しいマウスラインの生成を伴う経済的および時間的な制限を大幅に減らすのに役立ち、異なる発達年齢で脳の遠い領域に由来する細胞型間の相互作用の研究において特に重要になる。ここでは、空間的および時間的に分離された細胞集団のターゲットを可能にする二重エレクトロポレーション戦略について説明する。このアプローチにより、選択した蛍光タンパク質を使用して異なる場所の細胞の異なるサブタイプを標識して視覚化したり、これらの異なる細胞によって発現する目的の遺伝子を適切な時期に操作したりできます。この戦略は、子宮内エレクトロポレーションの可能性を高め、密接な接触を確立するために移行する時間的および空間的に分離された細胞集団の挙動を研究する強力なツールを提供し、軸索予測を介した長距離相互作用を研究し、時間的および経済的コストを削減する。
Introduction
大脳皮質は非常に複雑で複雑に組織化された構造です。このような組織の程度を達成するために、皮質投影ニューロンは、その側頭発生、皮質プレート内の最終目的地への移行、および短距離および長距離接続の確立1、22を必要とする複雑な発達過程を経る。長い間、コルチコ形成を研究する古典的な方法は、関心のある遺伝子のノックアウトまたはノックインマウスモデルの使用に基づいていました。しかし、この戦略、特に条件付きノックアウトマウスの使用は時間と高価であり、遺伝的冗長性の存在や特定のCREドライバの欠如などに関する追加の問題を提示することがあります。これらの問題に対処するために生じたアプローチの1つは、今日では皮質の発達を研究するために広く使用されている、子宮エレクトロポレーション33、44です。子宮内エレクトロポレーションは、体細胞トランスジェネシスに使用される技術であり、神経幹細胞およびその子孫を生体内で標的化することを可能にする。この方法は、インビボでの遺伝子操作(すなわち、機能アッセイの利得または,損失)7、8、9、8生体9外および培養細胞8、10における電気泳動皮質を単離するための蛍光タンパク質105、6の発現によって細胞を標識するために使用することができる。56さらに、子宮内のエレクトロポレーションでは、標的領域の時間的および地域的制御が可能である。この技術は、多くの用途を有し、広く神経移動、幹細胞分裂、神経結合性、および他の被験者898、9、11、1211,12を研究するために使用されています。,
現在の原稿は、子宮エレクトロポレーションで二重と呼ぶ子宮エレクトロポレーション変異体の使用を記述し、異なる時間的および空間的起源を有する大脳皮質における細胞の相互作用を分析する。これらの研究は、いくつかのトランスジェニックラインの組み合わせ使用を必要とするため、マウスモデルを採用する際に完了するには非常に複雑です。本論文に記載されているプロトコルの応用例としては、隣接する細胞間の密接な相互作用の研究や、長距離投影による遠距離細胞間の相互作用の研究が挙げられる。この方法では、同じ胚上で時間的および空間的に分離された子宮エレクトロポレーション手術において2つの独立した独立を行い、関心のある異なる細胞集団を標的とする。このアプローチの利点は、野生型動物を使用して一方または両方のタイプのニューロンで遺伝子機能を操作する可能性です。さらに、これらの機能実験は、細胞質または膜タグ付き蛍光タンパク質の発現と組み合わせて、樹状突起および軸索を含む標的細胞の微細形態を可視化し、細胞相互作用の可能性のある差異をコントロール(すなわち、蛍光タンパク質で標識した細胞のみ)に比較して分析することができる。
ここで説明するプロトコルは、新皮質内の細胞相互作用の研究に焦点を当てていますが、この戦略は、小脳15のような他の構造のサブパラリウムまたは視床13、14、,14または他の構造の細胞間相互作用のような子宮エレクトロポレーションで標的とすることができる皮質外領域との相互作用を調べるためにも使用できます。異なる領域のターゲット設定は、電極の向きとDNAが注入される心室(側面、第3、または第4)に基づいています。ここで説明した戦略では、機能実験における結合性/インナビネーションの一般的な変化を評価するのに役立つ、かなりの数の細胞にラベルを付けることができます。それにもかかわらず、接続性の微細な変化を研究するために、子宮エレクトロポレーション中の改変版を使用して、まばらな標識を得て、単一細胞16を同定することができる。要約すると、子宮内の二重エレクトロポレーションは、時間的および空間的に分離された細胞集団を標的化し、制御条件下でまたは機能的実験と組み合わせて、それらの相互作用を詳細に研究することを可能にする汎用性の高い方法であり、時間的および経済的コストを大幅に削減する。
Protocol
Representative Results
Discussion
大脳皮質のような細胞密度の高い領域における生体内での細胞間相互作用の研究は複雑な作業です。神経突起を標識する抗体の使用を含む従来のアプローチは、異なる細胞集団に対する特異的マーカーがないため、適切ではない。特定の細胞型が蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスモデルの使用は、神経細胞のプロセスを可視化するのに有用であるが、これはそのようなモ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、クリスティーナ・アンドレス・カルボネルとバレンシア大学のアニマルケア施設のメンバーに対し、技術支援を求めて感謝している。また、イザベル・ファリニャスとサクラメント・R・フェロンの試薬と機器の共有に感謝したいと思います。I.M.Wは、インセラーシア・デ・エドゥカシオン・デ・バレンシア(GJIDI/2018/A/221)のガランティア・ジュベニル契約によって資金提供され、D.dA.Dはシエンシア大臣、イノバシオン・イ・ユニバーシダーデス(MICINN)(FPI-PRE2018-086150)によって資金提供されています。C.Gil-Sanzは、スペインのイノバシオン・イ・ウニバーシダーデス(MICINN)のスペイン大臣からラモン・イ・カハル・グラント(RYC-2015-19058)を保持しています。この作品はRYC-2015-19058およびSAF2017-82880-R(MICINN)に資金を提供しました。
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
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