टेम्पोरैली और स्थानिक रूप से अलग सेल आबादी को लक्षित करने के लिए यूटेरो इलेक्ट्रोपेशन में डबल
Summary
गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में डबल सेल आबादी को लक्षित करने की अनुमति देता है जो स्थानिक और अस्थायी रूप से अलग होते हैं। यह तकनीक सामान्य परिस्थितियों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके उन कोशिका आबादी के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए उपयोगी है, लेकिन रुचि के जीन को परेशान करने के लिए कार्यात्मक प्रयोगों के बाद भी।
Abstract
गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में वीवो डीएनए ट्रांसफर तकनीक है जो बड़े पैमाने पर स्तनधारी कोर्टिकोजेनेसिस में अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। यह प्रक्रिया मस्तिष्क वेंट्रिकल का लाभ उठाती है ताकि ब्याज के डीएनए की शुरूआत की अनुमति दी जा सके और आनुवंशिक सामग्री के प्रवेश द्वार को वेंट्रिकल, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अस्तर वाली कोशिकाओं में प्रत्यक्ष करने के लिए इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का उपयोग किया जाता है। यह विधि शोधकर्ताओं को वांछित कोशिकाओं को लेबल करने और/या उन कोशिकाओं में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की अनुमति देता है । इसमें न्यूरोनल माइग्रेशन, वंश ट्रेसिंग और अक्षीय पथवित्तीकरण को लक्षित करने वाले परख सहित कई अनुप्रयोग हैं। इस विधि की एक महत्वपूर्ण विशेषता इसका लौकिक और क्षेत्रीय नियंत्रण है, जो भ्रूणीय घातकता या विशिष्ट सीआरई चालक चूहों की कमी से संबंधित संभावित समस्याओं को दरकिनार करने की अनुमति देता है। इस तकनीक का एक और प्रासंगिक पहलू यह है कि यह आर्थिक और लौकिक सीमाओं को काफी कम करने में मदद करता है जिसमें नई माउस लाइनों की पीढ़ी शामिल है, जो विभिन्न विकासात्मक युगों में मस्तिष्क के दूर के क्षेत्रों में उत्पन्न होने वाले सेल प्रकारों के बीच बातचीत के अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाती है। यहां हम एक डबल इलेक्ट्रोपॉलिपेशन रणनीति का वर्णन करते हैं जो सेल आबादी को लक्षित करने में सक्षम बनाता है जो स्थानिक और अस्थायी रूप से अलग होते हैं। इस दृष्टिकोण के साथ हम चयनित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ विभिन्न स्थानों में कोशिकाओं के विभिन्न उपप्रकारों को लेबल कर सकते हैं ताकि उन्हें कल्पना की जा सके, और/या हम उचित समय पर इन विभिन्न कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए ब्याज के जीन में हेरफेर कर सकते हैं । यह रणनीति गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन की क्षमता को बढ़ाती है और अस्थायी और स्थानिक रूप से अलग कोशिका आबादी के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है जो घनिष्ठ संपर्क स्थापित करने के साथ-साथ अक्षीय अनुमानों के माध्यम से लंबी दूरी की बातचीत, लौकिक और आर्थिक लागत को कम करती है।
Introduction
सेरेब्रल कॉर्टेक्स एक बहुत ही जटिल और जटिल रूप से संगठित संरचना है। संगठन की ऐसी डिग्री प्राप्त करने के लिए, कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स जटिल विकास प्रक्रियाओं से गुजरते हैं, जिन्हें उनकी अस्थायी पीढ़ी, कॉर्टिकल प्लेट में अपने अंतिम गंतव्य पर जाने और छोटी और लंबी दूरी के कनेक्शन1,,2की स्थापना की आवश्यकता होती है। लंबे समय तक कॉर्टिकोजेनेसिस का अध्ययन करने का शास्त्रीय तरीका ब्याज के जीन के नॉकआउट या नॉक-इन मुरीन मॉडल के उपयोग पर आधारित था। हालांकि, इस रणनीति, और विशेष रूप से सशर्त नॉकआउट चूहों का उपयोग, समय लेने वाली और महंगी है, और कभी-कभी अन्य मुद्दों के अलावा आनुवंशिक अतिरेक या विशिष्ट सीआरई ड्राइवरों की कमी के अस्तित्व के बारे में अतिरिक्त समस्याएं प्रस्तुत करती हैं। उन समस्याओं को दूर करने का प्रयास करने के लिए जो दृष्टिकोण पैदा हुआ है और आजकल कॉर्टिकल विकास का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है , वह गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन3,4में है । गर्भाशय इलेक्ट्रोप्यूशन में एक तकनीक है जो दैहिक ट्रांसजेनेसिस के लिए उपयोग की जाती है, जो तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतान के वीवो लक्ष्यीकरण में अनुमति देती है। इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन 5,6की अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जा सकता है, वीवो में जीन हेरफेर के लिए(अर्थात,लाभ या कार्य के रूप की हानि)7,8,,9,विट्रो और संस्कृति कोशिकाओं में इलेक्ट्रोपोटेड कोर्टिस को अलग करने के लिए8,,,10। इसके अलावा, गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में लक्षित क्षेत्र के लौकिक और क्षेत्रीय नियंत्रण की अनुमति देता है। इस तकनीक में कई अनुप्रयोग हैं और इसका व्यापक रूप से उपयोग न्यूरोनल माइग्रेशन, स्टेम सेल डिवीजन, न्यूरोनल कनेक्टिविटी और अन्य विषयों8,,9,11, 12,12का अध्ययन करने के लिए किया गया है।,
वर्तमान पांडुलिपि विभिन्न लौकिक और स्थानिक मूल के साथ सेरेब्रल कॉर्टेक्स में कोशिकाओं की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉक्राइशन में डबल कहा जाता है, गर्भाशय में एक utero इलेक्ट्रोपॉरेशन संस्करण के उपयोग का वर्णन करता है । ये अध्ययन मुरीन मॉडल को नियोजित करते समय पूरा करने के लिए बेहद जटिल हैं क्योंकि उन्हें कई ट्रांसजेनिक लाइनों के संयुक्त उपयोग की आवश्यकता होती है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल के कुछ अनुप्रयोगों में पड़ोसी कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ बातचीत का अध्ययन, साथ ही लंबी दूरी के अनुमानों के माध्यम से दूर की कोशिकाओं के बीच बातचीत शामिल है। विधि ब्याज की विभिन्न कोशिका आबादी को लक्षित करने के लिए एक ही भ्रूण पर, अलग अस्थायी और स्थानिक रूप से, utero इलेक्ट्रोप्यूटेशन सर्जरी में दो स्वतंत्र प्रदर्शन की आवश्यकता है। इस दृष्टिकोण का लाभ जंगली प्रकार के जानवरों का उपयोग करके एक या दोनों प्रकार के न्यूरॉन्स में जीन फ़ंक्शन में हेरफेर करने की संभावना है। इसके अलावा, इन कार्यात्मक प्रयोगों को साइटोप्लाज्मिक या झिल्ली-टैग किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि लक्षित कोशिकाओं की ठीक आकृति की कल्पना की जा सके, जिसमें डेंड्राइट्स और एक्सॉन शामिल हैं, और नियंत्रण की तुलना में सेलुलर इंटरैक्शन में संभावित अंतर का विश्लेषण करें (यानी, कोशिकाएं केवल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल की जाती हैं)।
यहां चित्रित प्रोटोकॉल नियोकॉर्टेक्स के अंदर सेलुलर इंटरैक्शन के अध्ययन पर केंद्रित है, लेकिन इस रणनीति का उपयोग एक्सट्राकॉर्टिकल क्षेत्रों के साथ बातचीत की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसे गर्भाशयमीय या थैलेसीमिया13,14,या अन्य संरचनाओं में सेल-सेल इंटरैक्शन जैसे गर्भाशयम15जैसे गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में लक्षित किया जा सकता है।, विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करना इलेक्ट्रोड के अभिविन्यास और वेंट्रिकल पर आधारित है जहां डीएनए इंजेक्ट किया जाता है (पार्श्व, तीसरा, या चौथा)। यहां वर्णित रणनीति के साथ, हम पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को लेबल कर सकते हैं, जो कार्यात्मक प्रयोगों में कनेक्टिविटी/इनरवेशन में सामान्य परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है । फिर भी, कनेक्टिविटी में ठीक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, कोई भी गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में संशोधित संस्करणों का उपयोग करने के लिए विरल लेबलिंग प्राप्त कर सकता है और एकल कोशिकाओं की पहचान कर सकता है16। संक्षेप में, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में डबल एक बहुमुखी विधि है जो अस्थायी और स्थानिक रूप से अलग कोशिका आबादी को लक्षित करने और उनकी बातचीत का विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देती है, या तो नियंत्रण स्थितियों में या कार्यात्मक प्रयोगों के साथ संयुक्त, अस्थायी और आर्थिक लागत को काफी कम करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेरेब्रल कॉर्टेक्स जैसे उच्च सेलुलर घनत्व वाले क्षेत्रों में वीवो में सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन एक जटिल कार्य है। विभिन्न सेल आबादी के लिए विशिष्ट मार्कर की कमी के कारण न्यूराइट्स लेबल करने के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक क्रिस्टीना एंड्रेस कार्बोनेल और तकनीकी सहायता के लिए यूनीवर्सिड डी वेलेंसिया की एनिमल केयर सुविधा के सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी रिएजेंट्स के लिए इसाबेल Fariñas और सैक्रामेंटो आर Ferrón शुक्रिया अदा करना चाहते है और हमारे साथ अपने उपकरणों को साझा । I.M.W को कॉन्सेलेरिया डी एडुकासिओन डी वेलेंसिया (जीजीडीआई/2018/ए/221) से गार्न्टिया जुवेनिल अनुबंध द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, डी.डीए.डी को मिनिस्टरियो डी सिन्सिया, इनोवासिओन वाई यूनीवर्सिडेस (MICINN) (एफपीआई-PRE2018-086150) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। सी गिल-सैंज के पास स्पेन के मिनिस्टरियो डी सिन्सिया, इनोवासिओन वाई यूनीवर्सिड्स (एमआईसीएन) से रामोन वाई कैजल ग्रांट (RYC-2015-19058) है। इस कार्य को RYC-2015-19058 और SAF2017-82880-R (MICINN) वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
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