Dobbel i Utero elektroporasjon til mål timelig og romlig separerte cellepopulasjoner
Summary
Dobbel i utero elektroporasjon gjør det mulig å målrette cellepopulasjoner som er romlig og timelig separert. Denne teknikken er nyttig for å visualisere interaksjoner mellom disse cellepopulasjonene ved hjelp av fluorescerende proteiner under normale forhold, men også etter funksjonelle eksperimenter for å perturb gener av interesse.
Abstract
In utero elektroporasjon er en in vivo DNA-overføringsteknikk som brukes mye til å studere molekylære og cellulære mekanismer underliggende pattedyrkortikogenese. Denne prosedyren utnytter hjernen ventriklene for å tillate innføring av DNA av interesse og bruker et par elektroder for å lede inngangen til det genetiske materialet inn i cellene som fôrer ventrikkelen, nevrale stamceller. Denne metoden gjør det mulig for forskere å merke de ønskede cellene og / eller manipulere uttrykket av gener av interesse for disse cellene. Den har flere applikasjoner, inkludert analyser rettet mot nevronal migrasjon, avstamning sporing, og axonal pathfinding. Et viktig trekk ved denne metoden er dens timelige og regionale kontroll, slik at omgåelse av potensielle problemer knyttet til embryonisk dødelighet eller mangel på spesifikke CRE drivermus. Et annet relevant aspekt ved denne teknikken er at det bidrar til å redusere de økonomiske og timelige begrensningene som involverer generering av nye muselinjer, som blir spesielt viktig i studiet av interaksjoner mellom celletyper som stammer fra fjerne områder av hjernen i ulike utviklingsaltider. Her beskriver vi en dobbel elektroporasjonsstrategi som muliggjør målretting av cellepopulasjoner som er romlig og timelig separert. Med denne tilnærmingen kan vi merke forskjellige undertyper av celler på forskjellige steder med utvalgte fluorescerende proteiner for å visualisere dem, og / eller vi kan manipulere gener av interesse uttrykt av disse forskjellige cellene til de aktuelle tidspunktene. Denne strategien forbedrer potensialet i in utero elektroporasjon og gir et kraftig verktøy for å studere oppførselen til timelig og romlig separerte cellepopulasjoner som migrerer for å etablere nære kontakter, samt langsiktige interaksjoner gjennom axonale anslag, noe som reduserer temporale og økonomiske kostnader.
Introduction
Hjernebarken er en svært kompleks og intrikat organisert struktur. For å oppnå en slik grad av organisering, går kortikale projeksjonsnevroner gjennom komplekse utviklingsprosesser som krever deres timelige generasjon, migrasjon til deres endelige destinasjon i kortikal plate, og etablering av kort- og langdistanseforbindelser1,2. I lang tid var den klassiske måten å studere kortikogenese basert på bruk av knockout eller knock-in murine modeller av gener av interesse. Imidlertid er denne strategien, og spesielt bruken av betingede knockoutmus, tidkrevende og dyrt, og noen ganger presenterer ytterligere problemer med eksistensen av genetisk redundans eller mangel på spesifikke CRE-drivere, blant andre problemer. En av tilnærmingene som oppsto for å prøve å løse disse problemene, og det er i dag mye brukt til å studere kortikal utvikling er i utero elektroporasjon3,4. In utero elektroporasjon er en teknikk som brukes til somatisk transgenese, slik at in vivo målretting av nevrale stamceller og deres avkom. Denne metoden kan brukes til å merke celler ved uttrykk for fluorescerende proteiner5,6, for genmanipulering in vivo (dvs. gevinst eller tap av funksjonsanalyser)7,8,9, for å isolere elektroporerte kortikater in vitro og kulterende celler8,10. Videre, i utero elektroporasjon tillater timelig og regional kontroll av det målrettede området. Denne teknikken har mange applikasjoner og har vært mye brukt til å studere nevronal migrasjon, stamcelledeling, nevronal tilkobling og andre8,,9,,11,,12.
Det nåværende manuskriptet beskriver bruken av en in utero elektroporasjonsvariant, kalt dobbel i utero elektroporasjon, for å analysere samspillet mellom celler i hjernebarken med forskjellig temporal og romlig opprinnelse. Disse studiene er svært komplekse å fullføre når de ansetter murine modeller fordi de krever kombinert bruk av flere transgene linjer. Noen av anvendelsene av protokollen som er beskrevet i dette papiret inkluderer studiet av nære interaksjoner mellom nærliggende celler, samt interaksjoner mellom fjerne celler gjennom langtrekkende projeksjoner. Metoden krever å utføre to uavhengige i utero elektroporasjon operasjoner, separert timelig og romlig, på de samme embryoene for å målrette ulike cellepopulasjoner av interesse. Fordelen med denne tilnærmingen er muligheten for å manipulere genfunksjonen i en eller begge typer nevroner ved hjelp av villtype dyr. I tillegg kan disse funksjonelle eksperimentene kombineres med uttrykket av cytoplasmatiske eller membran-merkede fluorescerende proteiner for å visualisere den fine morfologien til målrettede celler, inkludert dendritter og aksoner, og analysere mulige forskjeller i cellulære interaksjoner sammenlignet med en kontroll (dvs. celler bare merket med fluorescerende protein).
Protokollen avgrenset her er fokusert på studiet av cellulære interaksjoner inne i neocortex, men denne strategien kan også brukes til å undersøke interaksjoner med ekstrakortikale områder som kan målrettes ved hjelp av i utero elektroporasjon, som subpallium eller thalamus13,14, eller celle-celle interaksjoner i andre strukturer, som cerebellum15. Målretting av ulike områder er basert på elektrodenes orientering og på ventrikkelen der DNA injiseres (lateral, tredje eller fjerde). Med strategien som er beskrevet her, kan vi merke et betydelig antall celler, noe som er nyttig for å evaluere generelle endringer i tilkobling / innervering i funksjonelle eksperimenter. Likevel, for å studere fine endringer i tilkobling, kan man bruke modifiserte versjoner av in utero elektroporasjon for å få sparser merking og identifisere enkeltceller16. Oppsummert er dobbel i utero elektroporasjon en allsidig metode som gjør det mulig å målrette timelig og romlig separerte cellepopulasjoner og studere deres interaksjoner i detalj, enten i kontrollforhold eller kombinert med funksjonelle eksperimenter, noe som reduserer temporale og økonomiske kostnader betydelig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien av celle-celle interaksjoner in vivo i regioner med høy cellulær tetthet som hjernebarken er en kompleks oppgave. Tradisjonelle tilnærminger inkludert bruk av antistoffer for å merke neurites er ikke egnet på grunn av mangel på spesifikke markører for ulike cellepopulasjoner. Bruken av transgene murinmodeller, hvor en bestemt celletype uttrykker et fluorescerende protein, er nyttig for å visualisere nevronale prosesser, men dette avhenger av tilgjengeligheten av slike modeller. Denne oppgaven er enda mer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Cristina Andrés Carbonell og medlemmer av Animal Care-anlegget i Universidad de Valencia for teknisk hjelp. Vi vil også takke Isabel Fariñas og Sacramento R. Ferrón for reagenser og dele utstyret sitt med oss. I.M.W er finansiert av en Garantía Juvenil kontrakt fra Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D er finansiert av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz har en Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) fra den spanske ministerenio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dette arbeidet ble finansiert RYC-2015-19058 og SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
