In Vivo Ciblage des cellules progénitrices neuronales dans le néocortex de Ferret par In Utero Electroporation
Summary
Présenté ici est un protocole pour effectuer la manipulation génétique dans le cerveau de furet embryonnaire en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode permet de cibler les cellules progénitrices neuronales dans le néocortex in vivo.
Abstract
La manipulation de l’expression des gènes in vivo au cours du développement embryonnaire est la méthode de choix lors de l’analyse du rôle des gènes individuels au cours du développement des mammifères. L’électroporation in utero est une technique clé pour la manipulation de l’expression génique dans le cerveau embryonnaire des mammifères in vivo. Un protocole pour l’électroporation in utero du néocortex embryonnaire des furets, un petit carnivore, est présenté ici. Le furet est de plus en plus utilisé comme modèle pour le développement du néocortex, parce que son néocortex présente une série de caractéristiques anatomiques, histologiques, cellulaires et moléculaires qui sont également présents chez les primates humains et non humains, mais absents dans les modèles de rongeurs, tels que la souris ou le rat. L’électroporation in utero a été exécutée au jour embryonnaire (E) 33, un stade de midneurogenesis dans le furet. L’électroporation in utero cible les cellules progénitrices neuronales qui tapissent les ventricules latéraux du cerveau. Pendant la neurogenèse, ces cellules progénitrices donnent naissance à tous les autres types de cellules neuronales. Ces travaux montrent des résultats et des analyses représentatifs à l’E37, jour postnatal (P) 1, et P16, correspondant à 4, 9 et 24 jours après l’électroporation in utero, respectivement. À un stade précoce, la progéniture des cellules ciblées se compose principalement de divers sous-types de progéniteur neuronal, alors qu’à des stades ultérieurs la plupart des cellules étiquetées sont des neurones postmitotiques. Ainsi, l’électroporation in utero permet l’étude de l’effet de la manipulation génétique sur les caractéristiques cellulaires et moléculaires de divers types de cellules neuronales. Grâce à son effet sur diverses populations cellulaires, l’électroporation in utero peut également être utilisée pour la manipulation des caractéristiques histologiques et anatomiques du néocortex de furet. Fait important, tous ces effets sont aigus et sont effectués avec une spécificité spatiotemporal déterminée par l’utilisateur.
Introduction
Le néocortex est la feuille extérieure du cerveau des mammifères et le siège des fonctions cognitives supérieures1,2,3,4,5. Afin d’obtenir une manipulation génétique aiguë dans le néocortex mammifère in vivo au cours du développement embryonnaire, deux méthodes différentes ont été explorées : l’infection virale6 et l’électroporation in utero7. Les deux méthodes permettent un ciblage efficace des cellules néocorticales, mais souffrent de certaines limitations. Le principal avantage de l’électroporation in utero par rapport à l’infection virale est la capacité d’atteindre la spécificité spatiale dans le néocortex, qui est atteint en régulant la direction du champ électrique.
Depuis l’électroporation a été montré pour faciliter l’entrée de l’ADN dans les cellules in vitro8, il a été appliqué pour fournir l’ADN dans divers vertébrés in vivo. En neurosciences développementales, l’électroporation in utero du néocortex de souris a été rapportée pour la première fois en 20019,10. Cette méthode consiste en une injection du mélange d’ADN dans le ventricule latéral du cerveau embryonnaire et l’application ultérieure du champ électrique à l’aide d’électrodes de pince à épiler, ce qui permet la précision spatiale7,11. L’électroporation in utero a depuis été appliquée pour délivrer des acides nucléiques afin de manipuler l’expression de gènes endogènes ou électrotopiques ajoutés dans le néocortex de souris. D’importants progrès ont été réalisés récemment en appliquant la méthodologie de l’édition du génome à médiation CRISPR/Cas9 via l’électroporation in utero dans le néocortex de souris pour effectuer (1) la perturbation des gènes dans les neurones postmitotes12,13 et les cellules progénitrices neuronales14, et (2) génome15 et épigénome16 édition.
Très peu de temps après le premier rapport chez la souris, l’électroporation in utero a été appliquée au rat embryonnaire néocortex17,18. Les non-rongeurs sont restés un défi jusqu’à ce que la première électroporation in utero des furets, un petit carnivore, a été signalé en 201219,20. Depuis lors, l’électroporation in utero des furets a été appliquée pour étudier les mécanismes du développement du néocortex en étiquetant les progéniteurs et neurones neuronaux20,21,22,23, manipulant l’expression des gènes endogènes, y compris l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas924, et en livrant des gènes ectopiques21,22,25, y compris les gènes spécifiques à l’homme26. En outre, l’électroporation in utero des furets a été utilisée pour traiter les caractéristiques du développement du néocortex humain dans des conditions pathologiques27,28.
Dans le contexte du développement du néocortex, les avantages de l’utilisation des furets comme organisme modèle par rapport aux souris sont dus au fait que les furets récapitulent mieux une série de caractéristiques humaines. Au niveau anatomique, les furets présentent un modèle caractéristique de pliage cortical, qui est également présent chez l’homme et la plupart des autres primates, mais est complètement absent chez les souris ou les rats4,29,30,31. Au niveau histologique, les furets ont deux zones germinales subventriculaires distinctes, appelées zones subventriculaires intérieures et extérieures (ISVZ et OSVZ, respectivement)32,33, séparées par la couche interne de fibre23. Ces caractéristiques sont également partagées avec les primates, y compris les humains, mais pas avec des souris34. L’ISVZ et l’OSVZ chez les furets et les humains sont peuplés de cellules progénitrices neuronales abondantes, tandis que la zone subventriculaire (SVZ) des souris ne contient que des progéniteurs neuronaux clairsemés21,32,35,36. Au niveau cellulaire, les furets présentent une forte proportion d’un sous-type d’ancêtres neuronaux appelés glies radiaux basaux ou externes (bRG ou oRG, respectivement), qui sont jugés instrumentaux pour l’expansion évolutive du néocortex mammifère34,37,38. bRG sont donc très abondants dans le néocortex foetal humain et embryonnaire furet, mais ils sont très rares dans le néocortex de souris embryonnaire35,36. En outre, furet bRG montre une hétérogénéité morphologique similaire à celle de l’homme bRG, de loin supérieure à la souris bRG21. Enfin, au niveau moléculaire, le développement du néocortex de furet montre des modèles d’expression génique très semblables à ceux du néocortex humain fœtal, qui sont présumés contrôler le développement du pliage cortical, entre autres39.
Les caractéristiques biologiques et moléculaires des cellules du furet bRG les rendent très prolifératifs, semblables à l’homme bRG. Il en résulte une production accrue de neurones et le développement d’un néocortex34élargi et très complexe. Ces caractéristiques font des furets d’excellents organismes modèles pour étudier les caractéristiques humaines du développement du néocortex qui ne peuvent pas être modélisées chez les souris26,40. Pour tirer pleinement parti du furet comme organisme modèle, la méthode présentée a été développée. Il se compose d’électroporation in utero d’embryons de furet E33 avec un plasmide exprimant GFP (pGFP) sous le contrôle d’un promoteur omniprésent, CAG. Les embryons électroporés peuvent ensuite être analysés de façon embryonnaire ou postnatale. Afin de réduire le nombre d’animaux sacrifiés, les furets femelles (jills) sont stérilisés par hystérectomie et donnés pour adoption comme animaux de compagnie. Si les embryons ciblés sont récoltés à des stades embryonnaires, une deuxième chirurgie est effectuée et les embryons sont enlevés par une césarienne, tandis que les jills sont hystérectomies. Si les embryons ciblés sont analysés à des stades postnatals, les jills sont hystérectomies après que les chiots ont été sevrés ou sacrifiés. Par conséquent, un protocole pour l’hystérectomie des jills est également présenté.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’électroporation in utero chez le furet est une technique importante, avec des avantages et des inconvénients par rapport à d’autres méthodes. Il y a des étapes et des limitations critiques à cette méthode, ainsi que des modifications potentielles et des applications futures à garder à l’esprit.
Depuis les travaux pionniers de Victor Borrell et de ses collègues sur la manipulation génétique du néocortex de furet postnatal par électroporation ou injection virale<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants aux services et aux installations de l’Institut Max Planck de biologie cellulaire moléculaire et de génétique pour le soutien exceptionnel apporté, notamment toute l’équipe des services biomédicaux (BMS) pour l’excellente élevage des furets et J. Peychl et son équipe de l’installation de microscopie légère. Nous sommes particulièrement reconnaissants à Katrin Reppe et Anna Pfeffer du BMS pour leur soutien vétérinaire exceptionnel et à Lei Xing du groupe Huttner pour leur aide aux chirurgies du furet.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B., Kaas, J. . Evolution of Nervous Systems 2e. 3, 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
