ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לביצוע מניפולציה גנטית במוח החמוס העוברי באמצעות באלקטרואידיות הרחם. שיטה זו מאפשרת מיקוד של תאי האבות העצביים בneocortex ב vivo.
Abstract
מניפולציה של ביטוי גנים ב vivo במהלך התפתחות עוברית היא שיטת הבחירה בעת ניתוח התפקיד של גנים בודדים במהלך התפתחות היונקים. באלקטרואידיות הרחם היא טכניקת מפתח למניפולציה של ביטוי גנים במוח היונק העוברי בvivio. פרוטוקול לאלקטרו-אידוי הרחם של הניאו-קורטקס העוברי של החמוסים, טורף קטן, מוצג כאן. החמוס משמש יותר ויותר כמודל להתפתחות neocortex, כי neocortex שלה מציג סדרה של תכונות אנטומיות, היסטולוגיות, תאיות, מולקולריות אשר נמצאים גם פרימטים אנושיים ולא אנושיים, אבל נעדר במודלים מכרסמים, כגון עכבר או חולדה. באלקטרו אידוי הרחם בוצע ביום העוברי (ה) 33, שלב midneurogenesis ב חמוס. באלקטרואידציה ברחם מטרות תאי האבות העצביים רירית החדרים הצדדיים של המוח. במהלך neurogenesis, תאים אלה של הצבי להוות את כל סוגי תאים עצביים אחרים. עבודה זו מציגה תוצאות וניתוחים מייצגים ב- E37, יום לאחר הלידה (P) 1 ו- P16, התואמים ל- 4, 9 ו- 24 ימים לאחר האלקטרואידציה של הרחם, בהתאמה. בשלבים מוקדמים יותר, הצטמיות של תאים ממוקדים מורכבת בעיקר של תת סוגים עצביים שונים, ואילו בשלבים מאוחרים יותר רוב התאים המסומנו הם נוירונים postmitotic. לכן, באלקטרואידיות הרחם מאפשרת לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התכונות הסלולריות והמולקולריות של סוגים שונים של תאים עצביים. באמצעות השפעתו על אוכלוסיות תאים שונים, באלקטרופורציה ברחם יכול לשמש גם למניפולציה של תכונות היסטולוגיות ואנטומיות של neocortex החמוס. חשוב לציין, כל ההשפעות האלה הן אקוטיות ומבוצעות עם ספציפיות spatiotemporal שנקבע על ידי המשתמש.
Introduction
neocortex הוא הסדין החלקי של המוח היונקים ואת המושב של תפקודים קוגניטיביים גבוהיםיותר 1,,2,,3,,4,,5. על מנת להשיג מניפולציה גנטית חריפה neocortex היונקים ב vivo במהלך ההתפתחות העוברית, נחקרו שתי שיטות שונות: זיהוםנגיפי 6 ובאלקטרופורציהברחם 7. שתי השיטות מאפשרות פילוח יעיל של תאים ניאו-קליפטיים, אך סובלות ממגבלות מסוימות. היתרון העיקרי של אלקטרופורציה ברחם בהשוואה לזיהום נגיפי הוא היכולת להשיג ספציפיות מרחבית בתוך neocortex, אשר מושגת על ידי ויסות הכיוון של השדה החשמלי.
מאז אלקטרופורציה הוצגה לראשונה כדי להקל על הכניסה של DNA לתוך התאיםבמבחנה 8, זה הוחל כדי לספק DNA לתוך בעלי חוליות שונים ב vivo. במדעי המוח ההתפתחותיים, באלקטרו אידוי הרחם של neocortex העכבר דווח לראשונה ב 20019,10. שיטה זו מורכבת הזרקה של תערובת ה-DNA בחדר החוץ של המוח העוברי ויישום הבא של השדה החשמלי באמצעות אלקטרודות פינצטה, המאפשר דיוקמרחבי 7,11. באלקטרופורציה ברחם הוחל מאז כדי לספק חומצות גרעין על מנת לתמרן את הביטוי של גנים אנדוגניים או חוץ רחמים הוסיף neocortex העכבר. התקדמות חשובה נעשתה לאחרונה על ידי יישום המתודולוגיה של CRISPR / Cas9 בתיווך עריכת הגנום באמצעות אלקטרופורציה ברחם neocortex העכבר לבצע (1) הפרעה גנטית בנוירונים postmitotic12,,13 ותאי אבקדום עצבי 14,ו (2)גנום 15 ו אפיגנום16 עריכה.
זמן קצר לאחר הדיווח הראשון בעכבר, באלקטרופורציה של הרחם הוחל על neocortex חולדהעוברית 17,18. לא מכרסמים נותרו אתגר עד הראשון באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים, טורף קטן, דווח ב 201219,20. מאז, באלקטרו אידוי הרחם של חמוסים הוחל כדי ללמוד את המנגנונים של התפתחות neocortex על ידי תיוג של פרוטוורים עצבייםונוירונים 20,21,2222,23, מניפולציה הביטוי של גנים אנדוגניים, כולל השימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas924, ועל ידי אספקת גנים חוץ רחמיים21 , 22,2522,כוללגנים ספציפיים לאדם 26. יתר על כן, באלקטרואידציה של רחם של חמוסים שימש כדי לטפל בתכונות של התפתחות neocortex אנושי בתנאיםפתולוגיים 27,28.
בהקשר של התפתחות neocortex, היתרונות של שימוש חמוסים כמו אורגניזם מודל לעומת עכברים הם בשל העובדה כי חמוסים טוב יותר לסכם סדרה של תכונות דמויי אדם. ברמה האנטומית, חמוסים מציגים תבנית אופיינית של קיפול קליפתי, אשרקיים גםבפרימטים אנושיים ורוב האחרים, אבל נעדר לחלוטין בעכברים אוחולדות 4,29,30,31. ברמה ההיסטולוגית יש שני אזורי נבט תת-ורטרליים נפרדים, המכונים האזורים התת-ורטרליים הפנימיים והפנימיים (ISVZ ו-OSVZ, בהתאמה)32,33,המופרדים על ידי שכבת הסיביםהפנימית 23. תכונות אלה משותפות גם עם פרימטים, כולל בני אדם, אך לא עם עכברים34. ISVZ ו OSVZ ב חמוסים ובני אדם מאוכלסים בשפע תאים עצביים אב אדם, בעוד האזור subventricular (SVZ) של עכברים מכיל רק אבות עצבייםדליל 21,32,35,36. ברמה התאית, חמוסים להפגין שיעור גבוה של תת סוג של אבות עצביים המכונה גליה בסיס או רדיאלית החוצה (bRG או oRG, בהתאמה), אשר נחשבים אינסטרומנטליים עבור ההתרחבות האבולוציונית של neocortexיונקים 34,37,38. bRG הם מכאן מאוד בשפע neocortex חמוס העוברי העוברי, אבל הם נדירים מאוד neocortex העכברהעוברי 35,36. יתר על כן, חמוס bRG מראה הטרוגניות מורפולוגית דומה לזה של bRG אנושי, הרבה יותר טוב עכבר bRG21. לבסוף, ברמה המולקולרית, פיתוח neocortex חמוס מראה דפוסי ביטוי גנים דומים מאוד לאלה של neocortex אנושי עוברי, אשר נחשבים לשלוט בהתפתחות של קיפול קליפתי, בין היתר39.
המאפיינים הביולוגיים והמולקולריים של החמוס bRG הופכים אותם לתווססים מאוד, בדומה ל-bRG האנושי. התוצאה היא ייצור מוגבר של נוירונים ופיתוח של neocortex מורחב ומורכב מאוד34. מאפיינים אלה הופכים חמוסים אורגניזמים מודל מעולה לחקר תכונות דמויי אדם של התפתחות neocortex כי לא ניתן לדגמןבעכברים 26,40. כדי לנצל את מלוא היתרונות של החמוס כאורגניזם מודל השיטה שהוצגה פותחה. הוא מורכב באלקטרו-אידוי רחם של עוברי חמוס E33 עם פלסמיד המביע GFP (pGFP) תחת שליטה של מקדם בכל מקום, CAG. לאחר מכן ניתן לנתח את העוברים המאלקטרו-אידויים באופן עוברי או לאחר הלידה. על מנת להפחית את מספר בעלי החיים שהוקרבו, חמוסים נקבה (ג’יל) מחטאים על ידי כריתת רחם ותרמו לאימוץ כחיות מחמד. אם העוברים המיויעדים נקטפים בשלבים עובריים, מתבצע ניתוח שני ועוברים מוסרים על ידי ניתוח קיסרי, בעוד שהנוברים עוברים כריתת רחם. אם העוברים המיויעדים מנותחים בשלבים שלאחר הלידה, ג’יל עובר כריתת רחם לאחר שהגורים נ גנחו או הוקרבו. לפיכך, מוצג גם פרוטוקול כריתת הרחם של ג’יל.
Protocol
Representative Results
Discussion
באלקטרו אידוי הרחם חמוס היא טכניקה חשובה, עם יתרונות וחסרונות ביחס לשיטות אחרות. ישנם שלבים ומגבלות קריטיים לשיטה זו, כמו גם שינויים פוטנציאליים ויישומים עתידיים שיש לזכור.
מאז עבודתו החלוצית של ויקטור בורל ועמיתיו על מניפולציה גנטית של neocortex חמוס שלאחר הלידהבאמצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לשירותים ומתקנים של מכון מקס פלאנק לביולוגיה וגנטיקה של תאים מולקולריים על התמיכה יוצאת הדופן הניתנת, במיוחד כל הצוות של השירותים הביו-רפואיים (BMS) על גידול מצוין של חמוסים וג’יי פיכל וצוותו של מתקן המיקרוסקופיה הקלה. אנו אסירי תודה במיוחד קטין Reppe ואנה Pfeffer מ BMS לתמיכה וטרינרית יוצאת דופן ליי Xing מהקבוצה Huttner לסיוע עם ניתוחים חמוס.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B., Kaas, J. . Evolution of Nervous Systems 2e. 3, 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
