Summary

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Published: May 06, 2020
doi:

Summary

Presentato qui è un protocollo per eseguire la manipolazione genetica nel cervello furetto embrionale utilizzando in utero elettroporazione. Questo metodo consente di indirizzare le cellule progenitrici neurali nella neocorteccia in vivo.

Abstract

La manipolazione dell’espressione genica in vivo durante lo sviluppo embrionale è il metodo di scelta quando si analizza il ruolo dei singoli geni durante lo sviluppo dei mammiferi. In utero l’elettroporazione è una tecnica chiave per la manipolazione dell’espressione genica nel cervello di mammifero embrionale in vivo. Qui viene presentato un protocollo per l’elettroporazione in utero della neocorteccia embrionale dei furetti, un piccolo carnivoro. Il furetto è sempre più utilizzato come modello per lo sviluppo della neocorteccia, perché la sua neocorteccia presenta una serie di caratteristiche anatomiche, istologiche, cellulari e molecolari che sono presenti anche nei primati umani e non umani, ma assenti nei modelli di roditori, come il topo o il ratto. In utero l’elettroporazione è stata eseguita al giorno embrionale (E) 33, uno stadio di midneurogenesi in furetto. Nell’elettroporazione in utero si rivolge alle cellule progenitrici neurali che rivestono i ventricoli successivi del cervello. Durante la neurogenesi, queste cellule progenitrici danno origine a tutti gli altri tipi di cellule neurali. Questo lavoro mostra risultati rappresentativi e analisi all’E37, giorno postnatale (P) 1 e P16, corrispondenti rispettivamente a 4, 9 e 24 giorni dopo l’elettroporazione in utero. Nelle fasi iniziali, la progenie delle cellule mirate è costituita principalmente da vari sottotipi di progenitori neurali, mentre nelle fasi successive la maggior parte delle cellule etichettate sono neuroni postmitotici. Così, in utero l’elettroporazione consente lo studio dell’effetto della manipolazione genetica sulle caratteristiche cellulari e molecolari di vari tipi di cellule neurali. Attraverso il suo effetto su varie popolazioni cellulari, in utero l’elettroporazione può essere utilizzata anche per la manipolazione delle caratteristiche istologiche e anatomiche della neocorteccia del furetto. È importante sottolineare che tutti questi effetti sono acuti e vengono eseguiti con una specificità spatiotemporale determinata dall’utente.

Introduction

La neocorteccia è il foglio esterno del cervello dei mammiferi e la sede delle funzioni cognitive superiori1,2,3,4,5. Per ottenere una manipolazione genetica acuta nella neocorteccia di mammifero in vivo durante lo sviluppo embrionale, sono stati esplorati due diversi metodi: l’infezione virale6 e l’elettroporazione utero7. Entrambi i metodi consentono un targeting efficiente delle cellule neocorticali, ma soffrono di alcune limitazioni. Il principale vantaggio dell’elettroporazione in utero rispetto all’infezione virale è la capacità di raggiungere la specificità spaziale all’interno della neocorteccia, che si ottiene regolando la direzione del campo elettrico.

Dal momento che l’elettroporazione è stata dimostrata per facilitare l’ingresso del DNA nelle cellule in vitro8, è stato applicato per fornire il DNA in vari vertebrati in vivo. Nella neuroscienza dello sviluppo, in utero l’elettroporazione della neocorteccia del topo è stata riportata per la prima volta nel 20019,10. Questo metodo consiste in un’iniezione della miscela di DNA nel ventricolo laterale del cervello embrionale e dalla successiva applicazione del campo elettrico utilizzando elettrodi tweezer, che consente la precisione spaziale7,11. In utero l’elettroporazione è stata poi applicata per fornire acidi nucleici al fine di manipolare l’espressione di geni endogeni o aggiunti ectopicamente nella neocorteccia del topo. Recentemente sono stati compiuti importanti progressi applicando la metodologia dell’editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9 tramite l’elettroporazione in utero nella neocorteccia del topo per eseguire (1) l’interruzione genica nei neuroni postmitotici12,13 e le cellule progenitricineurali 14e (2) il genoma15 e l’epigenoma16.

Poco dopo il primo rapporto nel topo, in utero l’elettroporazione è stata applicata alla neocorteccia di rattoembrionale 17,18. I non roditori sono rimasti una sfida fino a quando il primo in utero elettroporazione di furetti, un piccolo carnivoro, è stato segnalato nel 201219,20. Da allora, in utero l’elettroporazione dei furetti è stata applicata per studiare i meccanismi di sviluppo della neocorteccia etichettando progenitori neurali e neuroni20,21,22,23, manipolando l’espressione di geni endogeni, compreso l’uso della tecnologia CRISPR/Cas924, e fornendo geni ectopici21,22,25, compresi i geni specifici dell’uomo26. Inoltre, in utero l’elettroporazione dei furetti è stata utilizzata per affrontare le caratteristiche dello sviluppo umano della neocorteccia in condizionipatologiche 27,28.

Nel contesto dello sviluppo della neocorteccia, i vantaggi dell’uso dei furetti come organismo modello rispetto ai topi sono dovuti al fatto che i furetti ricapitolano meglio una serie di caratteristiche simili a quella umana. A livello anatomico, i furetti presentano un caratteristico modello di piegatura corticale, che è presente anche nell’uomo e nella maggior parte degli altri primati, ma è completamente assente nei topi o nei ratti4,29,30,31. A livello istologico i furetti hanno due distinte zone germicolari subventricolari, denominate zone subventricolari interne ed esterne (rispettivamente ISV e OSV)32,33, separate dallo strato di fibrainterna 23. Queste caratteristiche sono condivise anche con i primati, compresi gli esseri umani, ma non con itopi 34. I fursoli e gli esseri umani sono popolati da abbondanti cellule progenitrici neurali, mentre la zona subventricolare (SV) dei topi contiene solo progenitori neurali sparse21,32,35,36. A livello cellulare, i furetti presentano un’alta percentuale di un sottotipo di progenitori neurali denominati glia radiali basali o esterni (rispettivamente bRG o oRG), che sono considerati strumentali per l’espansione evolutiva della neocorteccia mammifera34,37,38. BRG sono quindi molto abbondanti nella neocorteccia di furetti umani ed embrionali fetali, ma sono molto rari nella neocorteccia di topo embrionale35,36. Inoltre, il furetto bRG mostra un’eterogeneità morfologica simile a quella della bRG umana, di gran lunga superiore al topo bRG21. Infine, a livello molecolare, lo sviluppo della neocorteccia di furetti mostra modelli di espressione genica molto simili a quelli della neocorteccia umana fetale, che si presume controllino lo sviluppo del ripiegamento corticale, tra le altrecose 39.

Le caratteristiche biologiche e molecolari delle cellule del furetto bRG le rendono altamente proliferative, simili a bRG umane. Ciò si traduce in una maggiore produzione di neuroni e lo sviluppo di una neocorteccia espansa e altamente complessa34. Queste caratteristiche rendono i furetti eccellenti organismi modello per lo studio delle caratteristiche umane dello sviluppo della neocorteccia che non possono essere modellate neitopi 26,40. Per sfruttare appieno il furetto come organismo modello è stato sviluppato il metodo presentato. Consiste nell’elettroporazione in utero di embrioni di furetti E33 con un plasmide che esprime GFP (pGFP) sotto il controllo di un promotore onnipresente, CAG. Gli embrioni elettroporati possono quindi essere analizzati embrionalmente o postnatalmente. Al fine di ridurre il numero di animali sacrificati, i furetti femminili (jills) vengono sterilizzati dall’isterectomia e donati per l’adozione come animali domestici. Se gli embrioni mirati vengono raccolti in fasi embrionali, viene eseguito un secondo intervento chirurgico e gli embrioni vengono rimossi da un taglio cesareo, mentre le jills sono isterectomizzate. Se gli embrioni mirati vengono analizzati in fasi postnatali, le jill vengono isterectomizzate dopo che i cuccioli sono stati svezzati o sacrificati. Quindi, viene presentato anche un protocollo per l’isterectomia delle jills.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in accordo con la Legislazione tedesca sul benessere degli animali dopo l’approvazione da parte della Landesdirektion Sachsen (licenze TVV 2/2015 e TVV 21/2017). 1. Preparazione per l’elettroporazione in utero Preparare la miscela di DNA. In questo protocollo viene utilizzata una concentrazione finale di 1 g/L di pGFP. Sciogliere il DNA in PBS e integrare con 0.1% Fast Green per facilitare la visualizzazione. Una volta preparata, me…

Representative Results

In utero l’elettroporazione dei furetti all’E33 ha portato al targeting delle cellule del progenitore neurale che rivestono la superficie ventricolare della neocorteccia embrionale (Figura 1). Queste cellule sono chiamate progenitori apici e sono altamente proliferative, dando origine a tutti gli altri tipi di cellule durante lo sviluppo. Sulla divisione asimmetrica, i progenitori apici hanno generato un altro progenitore afonico e una cellula più differenziata, tipicamente un progenitore b…

Discussion

In utero l’elettroporazione nel furetto è una tecnica importante, con vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi. Esistono passaggi critici e limitazioni a questo metodo, nonché potenziali modifiche e applicazioni future da tenere a mente.

Dal lavoro pionieristico di Victor Borrell e colleghi sulla manipolazione genetica della neocorteccia di furetti postnatali tramite elettroporazione o iniezione virale35,42,<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati ai Servizi e Alle Strutture del Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics per l’eccezionale supporto fornito, in particolare l’intero team dei servizi biomedici (BMS) per l’eccellente allevamento di furetti e J. Peychl e il suo team del Light Microscopy Facility. Siamo particolarmente grati a Katrin Reppe e Anna Pfeffer del BMS per l’eccezionale supporto veterinario e a Lei Xing del gruppo Huttner per aver assistito con interventi chirurgici in furetto.

Materials

1ml syringe BD 309628 Electroporation
4-0 Vicryl suture Ethicon V392ZG Surgery
Aluminium spray cp-pharma 98017 Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) WDT 6301 Surgery
Cappilary holder WPI MPH6S12 Electroporation
Dexpanthenol Ointment solution Bayer 6029009.00.00 Surgery
Drape sheet 45x75cm Hartmann 2513052 Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm BTX 45-0489 Electroporation
Electroporator BTX ECM830 Electroporation
Fast Green Sigma F7258-25G Electroporation
Ferret Mustela putorius furo Marshall NA Experimental organism
Fiber optic light source Olympus KL1500LCD Electroporation
Forceps Allgaier instrumente 08-033-130 Surgery
Forceps 3C-SA Rubis Tech 3C-SA Surgery
Forceps 55 Dumostar 11295-51 Surgery
Forceps 5-SA Rubis Tech 5-SA Surgery
Gauze swabs large Hartmann 401723 Surgery
Gauze swabs small Hartmann 401721 Surgery
GFAP antibody Dako Z0334 Antibody
GFP antibody Aves labs GFP1020 Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) Sutter Instrument BF120-69-10 Electroporation
Glucose Bela-pharm K4011-02 Surgery
Heat pad Hans Dinslage Sanitas SHK18 Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) Meda 997437 Surgery
Isofluran CP 21311 Surgery
Loading tips 20µl Eppendorf #5242 956.003 Electroporation
Metamizol WDT 99012 Surgery
Metzenbaum dissecting scissors Aesculap BC600R Surgery
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97 Electroporation
pCAGGS-GFP NA NA From Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibody Millipore CBL407 Antibody
pH3 antibody Abcam ab10543 Antibody
Scalpel Aesculap 294200104 Surgery
Shaver Braun EP100 Surgery
Sox2 antibody R+D Systems AF2018 Antibody
Surgical clamp 13cm WDT 27080 Surgery
Surgical double spoon (Williger) WDT 27232 Surgery
Surgical drape WDT 28800 Surgery
Surgical scissors small FST 14090-09 Surgery
Suturing needle holder Aesculap BM149R Surgery
Tbr2 antibody Abcam ab23345 Antibody
Transfer pipette 3ml Fischer scientific 13439108 Surgery
Water bath Julabo TW2 Surgery

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Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (159), e61171, doi:10.3791/61171 (2020).

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