Utero Elektroporasyon in Ferret Neokorteks nöral progenitor hücrelerinin Vivo Hedefleme
Summary
Burada utero elektroporasyon kullanarak embriyonik gelincik beyin genetik manipülasyon gerçekleştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem in vivo neokorteks nöral progenitor hücrelerinin hedeflemesine olanak sağlar.
Abstract
Embriyonik gelişim sırasında in vivo gen ekspresyonunun manipülasyonu, memeli gelişimi sırasında tek tek genlerin rolünü analiz ederken tercih edilen yöntemdir. Rahim elektroporasyonu nda in vivo embriyonik memeli beyninde gen ekspresyonunun manipülasyonu için önemli bir tekniktir. Gelincik lerin embriyonik neokorteksinin rahim elektroporasyonunda küçük bir etobur için bir protokol burada sunulmuştur. Gelincik giderek neokorteks gelişimi için bir model olarak kullanılıyor, çünkü neokorteks, insan ve insan olmayan primatlarda da bulunan bir dizi anatomik, histolojik, hücresel ve moleküler özellikler sergiliyor, ancak fare veya sıçan gibi kemirgen modellerinde bulunmamaktadır. Uteros elektroporasyon da embriyonik gün yapıldı (E) 33, gelincik bir midnörogenez evresi. Rahim elektroporasyon beynin lateral ventrikülleri astar nöral progenitor hücreleri hedefler. Nörogenez sırasında, Bu progenitor hücreleri diğer tüm nöral hücre tiplerine yol açar. Bu çalışma, sırasıyla rahim elektroporasyonundan 4, 9 ve 24 gün sonrasına karşılık gelen E37, doğum sonrası gün (P) 1 ve P16’da temsili sonuçlar ve analizler göstermektedir. Daha önceki aşamalarda, hedeflenen hücrelerin soyundan çeşitli nöral progenitor alt tipleri esas oluşur, daha sonraki aşamalarında en etiketli hücreler postmitotik nöronlar ise. Böylece, rahim elektroporasyon nöral hücrelerin çeşitli hücresel ve moleküler özellikleri üzerinde genetik manipülasyon etkisi çalışma sağlar. Çeşitli hücre popülasyonları üzerindeki etkisi sayesinde, rahim elektroporasyon da gelincik neokorteks histolojik ve anatomik özellikleri manipülasyon için kullanılabilir. Daha da önemlisi, tüm bu etkiler akut ve kullanıcı tarafından belirlenen bir spatiotemporal özgüllük ile gerçekleştirilir.
Introduction
Neokorteks memeli serebrum dış levha ve yüksek bilişsel fonksiyonların koltuk1,2,3,4,5. Embriyonik gelişim sırasında memeli neokorteks in vivo akut genetik manipülasyon elde etmek için, iki farklı yöntem araştırılmıştır: viral enfeksiyon6 ve rahim elektroporasyon7. Her iki yöntem de neokortikal hücrelerin etkin hedeflemesine izin verir, ancak bazı sınırlamalardan muzdariptir. Viral enfeksiyona göre rahim elektroporasyonunun en büyük avantajı, elektrik alanının yönünü düzenleyerek elde edilen neokorteks içinde mekansal özgüllük elde edebilme yeteneğidir.
Elektroporasyon ilk in vitro8hücrelerine DNA girişini kolaylaştırmak için gösterildiğinden beri, in vivo çeşitli omurgalılar içine DNA teslim etmek için uygulanmıştır. Gelişimsel nörobilimde, fare neokorteks rahim elektroporasyonunda ilk olarak 2001 yılında bildirilmiştir9,10. Bu yöntem embriyonik beynin lateral ventrikül DNA karışımı bir enjeksiyon ve mekansal hassasiyet7sağlar cızırtıcı elektrotlar kullanarak elektrik alanının sonraki uygulama oluşur 7,11. Utero elektroporasyon beri fare neokorteks endojen veya ektonik eklenen genlerin ekspresyonu işlemek için nükleik asitler sunmak için uygulanmıştır. Son zamanlarda CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme metodolojisi uygulanarak fare neokorteksinde rahim elektroporasyonu ile (1) postmitotik nöronlarda12,,13 ve nöral progenitor hücrelerde 14 ve (2) genom15 ve epigenom16 düzenlemesi(1)gen bozulması gerçekleştirilmiştir.
Çok kısa bir süre sonra fare ilk rapor, rahim elektroporasyon embriyonik sıçan neokorteks uygulandı17,18. Olmayan kemirgenler gelincik rahim elektroporasyonunda ilk kadar bir meydan okuma kaldı, küçük bir etobur, rapor edildi 201219,20. O zamandan beri, gelincik rahim elektroporasyonu nda nöral progenitors ve nöronlar20etiketleyerek neokorteks geliştirme mekanizmaları çalışmak için uygulanmıştır20 ,21,22,23, CRISPR/ Cas9 teknolojisinin kullanımı da dahil olmak üzere endojen genlerin ekspresyonu manipüle24, ve ektopik genler teslim ederek21,22,25, insana özgü genler dahil olmak üzere26.22 Ayrıca, gelincik rahim elektroporasyonu patolojik koşullarda insan neokorteks gelişiminin özellikleri ele kullanılmıştır27,28.
Neokorteks gelişimi bağlamında, gelincikleri farelere göre model organizma olarak kullanmanın avantajları, gelinciklerin bir dizi insanbenzeri özelliği daha iyi özetlemesi gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Anatomik düzeyde, gelincik kortikal katlama karakteristik bir desen sergilemek, aynı zamanda insan ve diğer primatlar mevcut, ama tamamen fareler veya sıçanlarda yok4,29,30,31. Histolojik düzeyde gelincik iki farklı subventriküler germinal bölgeleri var, iç ve dış subventriküler bölgeler olarak anılacaktır (ISVZ ve OSVZ, sırasıyla)32,33, iç lif tabakası ile ayrılmış23. Bu özellikler aynı zamanda primatlarla da paylaşılır, insanlar da dahil olmak üzere, ancak fareler34ile değil. Gelincikve insanlarda ISVZ ve OSVZ bol nöral progenitor hücreleri ile doldurulur, sıçanların subventriküler zonu ise (SVZ) sadece seyrek nöral progenitors21,,32,35,36içerir . Hücresel düzeyde, gelincikler bazal veya dış radyal glia olarak adlandırılan nöral progenitors bir alt tip yüksek oranda sergilemek (bRG veya oRG, sırasıyla), hangi memeli neokorteks evrimsel genişleme için araç olarak kabul edilir34,37,38. bRG bu nedenle son derece fetal insan ve embriyonik gelincik neokorteks bol, ama embriyonik fare neokorteksçoknadirdir35 ,36. Ayrıca, gelincik bRG morfolojik heterojenite insan bRG benzer gösterir, çok fare bRG21üstün . Son olarak, moleküler düzeyde, gelişmekte olan gelincik neokorteks gen ekspresyonu desenleri son derece fetal insan neokorteks benzer gösterir, hangi kortikal katlama gelişimini kontrol etmek için tahmin edilmektedir, diğer şeyler arasında39.
Gelincik bRG hücre biyolojik ve moleküler özellikleri onları son derece çoğaltıcı hale, insan bRG benzer. Bu nöronların artan bir üretim ve genişletilmiş ve son derece karmaşık neokorteks gelişimi ile sonuçlanır34. Bu özellikler, gelincikleri farelerde modellenemez neokorteks gelişiminin insanbenzeri özelliklerini incelemek için mükemmel model organizmalar yapmak26,40. Gelincikmodel organizma olarak tam olarak yararlanmak için sunulan yöntem geliştirilmiştir. Bu her yerde organizatörü kontrolü altında bir plazmid ifade GFP ile E33 gelincik embriyolarının rahim elektroporasyonu oluşur (pGFP) her yerde organizatörü, CAG. Elektroporated embriyolar daha sonra embriyonik veya postnatal olarak analiz edilebilir. Kurban edilen hayvan sayısını azaltmak için, dişi gelincikler (jills) histerektomi ile sterilize edilir ve evcil hayvan olarak evlat edinilme için bağışlanır. Hedeflenen embriyolar embriyonik evrelerde hasat edilirse ikinci bir ameliyat yapılır ve embriyolar sezaryenle çıkarılır, jilller ise histerektomi edilir. Hedeflenen embriyolar doğum sonrası evrelerde analiz edilirse, yavrular bezlendikten veya kurban edildikten sonra jilller histerektomi edilir. Bu nedenle, jills histerektomi için bir protokol de sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rahim elektroporasyonunda gelincik diğer yöntemlere göre avantajları ve dezavantajları olan önemli bir tekniktir. Bu yöntemin kritik adımları ve sınırlamalarının yanı sıra olası değişiklikler ve gelecekteki uygulamaları da göz önünde bulundurabiliriz.
Victor Borrell ve elektroporasyon veya viral enjeksiyon yoluyla postnatal gelincik neokorteks genetik manipülasyon meslektaşlarının öncü çalışma beri35,42<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Max Planck Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetiği Enstitüsü’nün hizmet ve tesislerine, özellikle de gelinciklerin mükemmel yetiştiriciliği için Biyomedikal hizmetleri (BMS) tüm ekibi ve J. Peychl ve Işık Mikroskobu Tesisi ekibine verilen olağanüstü destek için müteşekkiriz. BmS’ten Katrin Reppe ve Anna Pfeffer’a istisnai veteriner desteği ve Huttner grubundan Lei Xing’e gelincik ameliyatlarına yardımcı oldukları için minnettarız.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B., Kaas, J. . Evolution of Nervous Systems 2e. 3, 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
