تحسين Fecundity والخصوبة المقايسة لAedes aegypti باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة البئر (لوحات EAgaL)
Summary
الموصوفة هي طريقة لتوفير الوقت والمكان لحساب البيض وتحديد معدلات فقس البعوض الفردية باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة الآبار، والتي يمكن أن تزيد بشكل كبير من حجم وسرعة البراز والخصوبة المقايسات.
Abstract
يمثل البعوض مشكلة صحية عامة كبيرة كناقلات لمختلف مسببات الأمراض. وبالنسبة للدراسات التي تتطلب تقييما لمعلمات لياقة البعوض، ولا سيما معدلات إنتاج البيض والفقس على المستوى الفردي، وضعت الطرق التقليدية عبئا كبيرا على المحققين بسبب كثافة العمالة العالية ومتطلبات الحيز المختبري. وصف هو وسيلة بسيطة باستخدام 24 لوحة زراعة الأنسجة جيدا مع agarose في كل بئر والتصوير الرقمي لكل بئر لتحديد أعداد البيض ومعدلات فقس على مستوى فردي مع انخفاض كبير في الوقت ومتطلبات الفضاء.
Introduction
إن مكافحة البعوض لحماية البشر من مسببات الأمراض المنقولة بالنواقل هدف هام للصحة العامة، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود لقاحات فعالة لمعظم مسببات الأمراض التي يحملها البعوض. تهدف العديد من الدراسات إلى الحد من لياقة البعوض بالتزامن معاستراتيجيةالحد من السكان المطبقة ميدانيا 1و2و3. وهذا يشمل دراسات مستفيضة لإنشاء البعوض المعدلة وراثيا و / أو CRISPR / Cas9 خطوط خروج المغلوب. تتطلب نهج تعديل السكان هذه تقييما مفصلا لمعلمات اللياقة البدنية الفردية4. تقنيات المختبر التقليدية لتقييم اللياقة البدنية للبعوض الإناث تشمل الاحتواء الفردي للبعوض الأنثوي المتزاوج الذي يتغذى على الدم في حاويات 100 مل5، تعديل 50 مل أنابيب مخروطية ، أو أنابيب لتربية Drosophila المعدلة عن طريق توفير أسطح رطبة باستخدام القطن الرطب وأقراص الورق المرشحة للoviposition (أي أوراق البيض)1،2،6،7. تتطلب هذه الطرق مساحة كبيرة نسبيا (على سبيل المثال ، 30 سم × 30 سم × 10 سم: W × L x H لمدة تصل إلى 100 أنبوب Drosophila) (الشكل 1) ، والتلاعب بأوراق البيض الفردية لحساب البيض ويرقات الفقس ، والتي يمكن أن تكون كثيفة العمالة. تقدم هذه المخطوطة طريقة لحساب بيض البعوض وتحديد معدلات الفقس باستخدام 24 لوحة بئر وأغاروز كسطح أوفييشن للتحايل على هذه القضايا8.
وفي الوقت نفسه، وصف إيوشينو وآخرونطريقة مفصلة باستخدام 12 و 24 لوحة بئر لأداء عد البيض الذي تم الحصول عليه من الإناث الفردية. يمثل بروتوكولها تحسنا كبيرا عن الطرق التقليدية في توفير الوقت والمكان9. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الذي وصفوه لا يزال يستخدم ورق التصفية الرطب كسطح للoviposition ، مما يتطلب تتكشف كل ورقة فردية للحصول على التهم ، كما يتم العثور على البيض في كثير من الأحيان تحت أو في طيات. كما أن بروتوكولها لم يتضمن استخدام تقنيات التصوير أو طريقة لحساب اليرقات.
يقدم هو طريقة محسنة لأداء اختبارات اللياقة البدنية لعدد البيض (أي البراز) ومعدل الفتحة (أي الخصوبة) باستخدام الآغروز كسطح oviposition في شكل لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا لAe. aegypti أن oviposit على الأسطح الرطبة. سميت هذه اللوحات لوحات “EAgaL” ، من Egg ، ارتفع الآغا، وLarva. توفر لوحات الآبار ال 24 هذه للبعوض الفردي سطحا ضئيلا لوضع البيض ، وبالتالي تبسيط وتقليل الوقت والجهد اللازمين لعد البيض واليرقات المفقسة وصيانته لبضعة أيام. يستخدم صفيحة EAgaL agarose شفافة لسطح oviposition ، مما يلغي الحاجة إلى التعامل مع أوراق البيض والعثور على البيض واليرقات عند فقسها ؛ تصوير كل بئر يؤسس سجل طويل الأجل المؤرشفة من النتائج ويفصل عملية العد في كل من الزمان والمكان من عملية تربية / المناولة، حيث الوقت غالبا ما تكون محدودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لوحة EAgaL يقلل بشكل كبير من العمل والوقت والفضاء لإجراء فحوصات البراز والخصوبة الفردية في Aedes aegypti بالمقارنة مع طريقة FT. وأسفرت المقارنة الأولية بين طريقة FT ولوحة EAgaL عن أوقات أقصر لجميع الخطوات (تم تطبيق تقنية التصوير على طريقة FT)(الجدول 1). كمرجع، يتم توفير تقدير تكاليف بد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تكساس A & M Agrilife البحوث الحشرات الأمراض الموجهة برنامج المنحة للتمويل. كما نشكر أعضاء مختبر أدلمان على مساعدتهم في تطوير هذه الطريقة والاقتراحات عند صياغة المخطوطة، وكذلك أعضاء مختبر كيفن مايلز. كما نشكر المراجعين والمحررين على مساعدتهم في تحسين هذه المخطوطة.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
