24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri
Summary
Açıklanan, yumurtaları saymak ve 24 kuyu doku kültürü plakası kullanarak bireysel sivrisineklerin kuluçka oranlarını belirlemek için zaman ve yerden tasarruf sağlayan bir yöntemdir, bu da doğurganlık ve doğurganlık testlerinin ölçeğini ve hızını önemli ölçüde artırabilir.
Abstract
Sivrisinekler, çeşitli patojenlerin vektörleri olarak önemli bir halk sağlığı sorununu temsil eder. Sivrisinek fitness parametrelerinin, özellikle yumurta üretimi ve kuluçka oranlarının bireysel düzeyde değerlendirilmesini gerektiren çalışmalar için, geleneksel yöntemler yüksek iş yoğunluğu ve laboratuvar alanı gereksinimleri nedeniyle araştırmacılara önemli bir yük yüklemektedir. Açıklanan, yumurta sayılarını ve kuluçka oranlarını önemli ölçüde azaltılmış zaman ve alan gereksinimleri ile bireysel düzeyde belirlemek için her kuyuda agarose ve her kuyunun dijital görüntülemesine sahip 24 kuyu doku kültürü plakası kullanan basit bir yöntemdir.
Introduction
İnsanları vektör kaynaklı patojenlerden korumak için sivrisineklerin kontrolü, esas olarak sivrisinekler tarafından taşınan patojenlerin çoğu için etkili aşıların bulunmaması nedeniyle önemli bir halk sağlığı hedefidir. Birçok çalışma, sahada uygulanabilir bir nüfus azaltma stratejisi 1 ,2,3ile birlikte sivrisinek kondisyonlarını azaltmayı amaçlamaktadır. Bu, transgenik sivrisinekler ve / veya CRISPR / Cas9 nakavt hatları oluşturmak için kapsamlı çalışmaları içerir. Bu tür popülasyon modifikasyon yaklaşımları, bireysel fitness parametrelerinin ayrıntılı bir değerlendirmesini gerektirir4. Dişi sivrisineklerin kondisyonunu değerlendirmek için geleneksel laboratuvar teknikleri, 100 mL kaplarda çift, kanla beslenen dişi sivrisineklerin5,modifiye edilmiş 50 mL konik tüplerde veya yumurtlama için nemli pamuk ve filtre kağıt diskleri kullanılarak nemli yüzeyler sağlanarak modifiye edilen Drosophila yetiştirme tüplerinin (yani yumurta kağıtları)1,2,6,7.’ninayrı ayrı muhafazasını içerir. Bu tür yöntemler nispeten geniş bir alan gerektirir (örneğin, 30 cm x 30 cm x 10 cm: 100 Drosophila tüpü için W x L x H) (Şekil 1) ve tek tek yumurta kağıtlarının, emek yoğun olabilecek yumurta ve kuluçka larvalarını saymak için manipülasyonu. Bu makale, sivrisinek yumurtalarını saymak ve bu sorunları atlatmak için bir yumurtlama yüzeyi olarak 24 kuyu plakası ve agarose kullanarak yumurtadan çıkma oranlarını belirlemek için bir yöntem sunar8.
Aynı anda, Ioshino ve ark.9, bireysel dişilerden elde edilen yumurta sayımını gerçekleştirmek için 12 ve 24 kuyu plakaları kullanarak ayrıntılı bir yöntem tanımladı. Protokolleri, zaman ve mekandan tasarruf9’dageleneksel yöntemlerden önemli bir gelişmeyi temsil etti. Bununla birlikte, tarif ettikleri protokol, ıslak filtre kağıdını yumurtlama için bir yüzey olarak kullanmaya devam eder, bu da yumurtalar genellikle altında veya kıvrımlarda bulunduğundan, sayımları almak için her bir kağıdın açılmasını gerektirir. Protokolleri ayrıca görüntüleme teknolojilerinin kullanımını veya larva sayımı için bir yöntemi içermede değildi.
Sunulan yumurta sayısı (yani, doğurganlık) ve yumurtadan çıkma oranı (yani doğurganlık) için uygunluk testlerini yapmak için geliştirilmiş bir yöntemdir, agarose’un nemli yüzeylerde ovipoz yapan Ae. aegypti için 24 kuyu doku kültürü plakası formatında bir yumurtlama yüzeyi olarak kullanılması. Bu plakalar E gg, Agarose ve Larva’dan “EAgaL”plakaları olarak adlandırıldı. Bu 24 kuyu plakası, bireysel sivrisineklere yumurta bırakmak için minimum bir yüzey sağlar, böylece yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları birkaç gün boyunca saymak ve sürdürmek için gereken zamanı ve çabayı basitleştirir ve büyük ölçüde azaltır. EAgaL plakası, yumurta kağıtlarını taşıma ve yumurtadan çıktığında yumurta ve larvaları bulma ihtiyacını ortadan kaldırır; her kuyunun fotoğraflandırılması, sonuçların uzun süreli arşivlenmiş bir kaydını oluşturur ve hem zaman hem de mekandaki sayım işlemini, zamanın genellikle sınırlı olduğu yetiştirme / taşıma işleminden ayırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaL plakası, FT yöntemine kıyasla Aedes aegypti’de bireysel doğurganlık ve doğurganlık tahlilleri yapmak için işgücünü, zamanı ve alanı büyük ölçüde azaltır. FT yöntemi ile EAgaL plakası arasındaki ön karşılaştırma, tüm adımlar için daha kısa sürelere neden oldu (FT yöntemine görüntüleme tekniği uygulandı) (Tablo 1). Referans olarak, tablo 2’debaşlangıç ve test başına (bir 24 kuyu EAgaL plakasına karşı 24 FT) maliyetlerin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Texas A&M Agrilife Research Böcek Vektörlü Hastalıklar Hibe Programı’nın finansmanı için teşekkür ederiz. Ayrıca, el yazmasını hazırlarken bu yöntem ve önerilerin geliştirilmesine yardımcı olan Adelman laboratuvar üyelerine ve Kevin Myles laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Ayrıca, bu makalenin daha iyi hale getirmek için yardımcı olan hakemlere ve editörlere teşekkür ederiz.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
