24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)
Summary
설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.
Abstract
모기는 다양한 병원균의 벡터로서 중요한 공중 보건 문제를 나타냅니다. 모기 피트 니스 매개 변수의 평가를 필요로 하는 그 연구에 대 한, 특히 계란 생산 및 개별 수준에서 해치 속도, 기존의 방법은 높은 노동 강도 와 실험실 공간 요구 사항으로 인해 조사자에 상당한 부담을 넣어. 설명된 간단한 방법은 각 웰에 아가로즈를 가진 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하고, 각 웰의 디지털 이미징을 사용하여 시간과 공간 요구 사항이 크게 감소된 개별 수준에서 계란 수와 해치 비율을 결정합니다.
Introduction
벡터 매개 병원균으로부터 인간을 보호하기 위한 모기의 통제는 중요한 공중 위생 목표입니다, 주로 모기에 의해 운반된 병원체의 대부분을 위한 효과적인 백신의 부족 때문입니다. 많은 연구는 현장 적용 인구 감소 전략1,2,3과함께 모기체력을감소시키는 것을 목표로합니다. 여기에는 형질전환 모기 및/또는 CRISPR/Cas9 녹아웃 라인을 만드는 광범위한 연구가 포함됩니다. 이러한 인구 수정 접근 방식은 개별 피트니스 매개 변수4에대한 상세한 평가가 필요합니다. 여성 모기의 적합성을 평가하는 종래의 실험실 기법은 100mL 용기5,변형된 50mL 원추형 튜브 또는 드로소필라 사육을 위한 튜브의 개별 봉쇄를 포함하며, 배란용 습기가 많은 표면을 제공함으로써 변형된 드로소필라 의 튜브(즉, 계란 종이)1,2,6,7. 이러한 방법은 상대적으로 큰 공간(예를 들어, 30cm x 30cm x 10cm: 최대 100개의 드로소필라 튜브에 대한 W x L x H)(도1)가필요하며, 계란을 계산하고 유충을 부화하기 위한 개별 계란 용지의 조작이 필요하며, 이는 노동 집약적일 수 있다. 이 원고는 모기 알을 계산하고 이러한 문제를 회피하기 위해 oviposition 표면으로 24 개의 우물 판과 아가로즈를 사용하여 해치 비율을 결정하는 방법을제시합니다 8.
동시에, Ioshino외. 9는 개별 여성에게서 얻은 계란 계수를 수행하기 위하여 12 및 24 의 우물 판을 사용하여 상세한 방법을 기술했습니다. 그들의 프로토콜은 시간과 공간9를절약하는 기존의 방법에서 상당한 개선을 나타냈다. 그러나, 그(것)들이 기술한 프로토콜은 계란이 수시로 밑에 또는 주름에서 찾아낸다기 때문에, 수를 얻기 위하여 각 개별 종이를 전개하는 것을 요구하는 oviposition를 위한 표면으로 젖은 필터 종이를 계속 이용하기 위하여 계속합니다. 그들의 프로토콜은 또한 화상 진찰 기술의 사용 또는 애벌레 계산을 위한 방법을 포함하지 않았습니다.
제시는 달걀 번호 (즉, fecundity)와 해치 비율 (즉, 불임)에 대한 적합성 애서를 수행하는 향상된 방법입니다 (즉, 불임) agarose를 사용하여 oviposition 표면으로 24 잘 조직 배양 플레이트 포맷으로 ae. aegypti는 습한 표면에 배란하는 aegypti. 이 플레이트는 Egg, 아가 로즈 및 L아르바에서 “EAgaL”플레이트로 명명되었습니다. 이 24 개의 웰 플레이트는 개별 모기에게 알을 낳기 위한 최소한의 표면을 제공하므로 며칠 동안 계란과 부화 된 애벌레를 계산하고 유지하는 데 필요한 시간과 노력을 단순화하고 크게 줄입니다. EAgaL 플레이트는 oviposition 표면에 반투명 아가로즈를 사용하며, 부화 시 계란 을 처리하고 계란과 애벌레를 찾을 필요가 없습니다. 각 웰을 촬영하는 것은 결과에 대한 장기 보관 된 기록을 설정하고 시간이 제한된 양육 / 처리 프로세스에서 시간과 공간 모두에서 계산 프로세스를 분리합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaL 플레이트는 FT 방법에 비해 Aedes aegypti에서 개별 적인 fecundity 및 불임 검사를 수행하기 위해 노동, 시간 및 공간을 크게 줄입니다. FT 방법과 EAgaL 플레이트 간의 예비 비교결과 모든 단계(영상 기술이 FT 방법에 적용되었다)(표1)에대한 짧은 시간.. 참고로, 시작 및 분석당 추정치(24개의 웰 EAgaL 플레이트 대 24FT)의 비용은 표 2에제공됩니다.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 자금 조달을 위한 텍사스 A&M 농업 연구 곤충 벡터 질병 보조금 프로그램에 감사드립니다. 또한 원고 작성 시 이 방법과 제안을 개발하는 데 도움을 준 Adelman Lab 회원과 케빈 마일스 랩 회원에게도 감사드립니다. 또한 이 원고를 더 잘 만들 수 있도록 도와준 리뷰어와 편집자들에게 감사드립니다.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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