Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)
Summary
Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.
Abstract
Muggen vertegenwoordigen een aanzienlijk probleem voor de volksgezondheid als vectoren van verschillende ziekteverwekkers. Voor die studies die een beoordeling van de geschiktheidsparameters van muggen vereisen, met name de productie van eieren en de broedsnelheden op individueel niveau, hebben conventionele methoden onderzoekers aanzienlijk belast vanwege de hoge arbeidsintensiteit en laboratoriumruimtevereisten. Beschreven is een eenvoudige methode met behulp van 24 put weefsel cultuur plaat met agarose in elke put en digitale beeldvorming van elke put om ei nummers en hatch rates te bepalen op een individueel niveau met aanzienlijk verminderde tijd en ruimte eisen.
Introduction
De bestrijding van muggen om mensen te beschermen tegen door vectoren overgedragen ziekteverwekkers is een belangrijk doel voor de volksgezondheid, voornamelijk vanwege het gebrek aan effectieve vaccins voor de meeste pathogenen die door muggen worden gedragen. Veel studies zijn gericht op het verminderen van de conditie van muggen in combinatie met een in het veld toepasbare strategie voor populatievermindering1,2,3. Dit omvat uitgebreide studies om transgene muggen en / of CRISPR / Cas9 knock-out lijnen te maken. Dergelijke benaderingen voor bevolkingsaanpassing vereisen een gedetailleerde beoordeling van individuele geschiktheidsparameters4. Conventionele laboratoriumtechnieken om de geschiktheid van vrouwelijke muggen te beoordelen, omvatten de individuele insluiting van gepaarde, met bloed gevoede vrouwelijke muggen in containers van 100 ml5, gemodificeerde conische buizen van 50 ml of buizen voor drosophila-opfok, gewijzigd door vochtige oppervlakken te bieden met vochtig katoen en filterpapierschijven voor ovipositie (d.w.z. eierpapier)1,2,6,7. Dergelijke methoden vereisen een relatief grote ruimte (bijv. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H voor maximaal 100 Drosophila-buizen) (figuur 1), en de manipulatie van individuele eierpapieren voor het tellen van eieren en broedlarven, die arbeidsintensief kunnen zijn. Dit manuscript presenteert een methode om muggeneieren te tellen en broedsnelheden te bepalen met behulp van 24 putplaten en agarose als een ovipositieoppervlak om deze problemen te omzeilen8.
Tegelijkertijd beschreven Ioshino et al.9 een gedetailleerde methode waarbij 12 en 24 putplaten werden gebruikt om eiertellingen uit te voeren die van individuele vrouwtjes werden verkregen. Hun protocol vertegenwoordigde een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele methoden om tijd en ruimte te besparen9. Het protocol dat ze beschreven blijft echter nat filterpapier gebruiken als een oppervlak voor ovipositie, waarvoor elk afzonderlijk papier moet worden uitgevouwen om tellingen te krijgen, omdat eieren vaak onder of in plooien worden gevonden. Hun protocol omvatte ook niet het gebruik van beeldvormingstechnologieën of een methode voor het tellen van larven.
Gepresenteerd is een verbeterde methode om fitnesstesten uit te voeren voor einummer (d.w.z. vruchtbaarheid) en broedsnelheid (d.w.z. vruchtbaarheid) met behulp van agarose als ovipositieoppervlak in een 24-put weefselkweekplaatformaat voor Ae. aegypti dat legboor op vochtige oppervlakken. Deze platen werden “EAgaL” platen genoemd, van Egg, Agarose en Larva. Deze 24 putplaten bieden individuele muggen een minimaal oppervlak om eieren te leggen, waardoor de tijd en moeite die nodig is om eieren en uitgebroede larven een paar dagen te tellen en te onderhouden, wordt vereenvoudigd en drastisch wordt verminderd. De EAgaL-plaat maakt gebruik van doorschijnende agarose voor het ovipositieoppervlak, waardoor het niet meer nodig is om met eierpapier om te gaan en de eieren en larven te vinden wanneer ze uitkomen; het fotograferen van elke put zorgt voor een langetermijn gearchiveerde registratie van de resultaten en scheidt het telproces in zowel tijd als ruimte van het opfok- / hanteringsproces, waar de tijd vaak beperkt is.
Protocol
Representative Results
Discussion
De EAgaL-plaat vermindert de arbeid, tijd en ruimte drastisch om individuele vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten in Aedes aegypti uit te voeren in vergelijking met de FT-methode. Voorlopige vergelijking tussen de FT-methode en de EAgaL-plaat resulteerde in kortere tijden voor alle stappen (beeldvormingstechniek werd toegepast op de FT-methode) (Tabel 1). Ter referentie: tabel 2 bevat een raming van de opstart- en testkosten (één EAgaL-plaat van 24 well versus 24 FT’s).</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program voor financiering. We danken ook de Adelman-lableden voor hulp bij het ontwikkelen van deze methode en suggesties bij het opstellen van het manuscript, evenals Kevin Myles-lableden. We danken ook de recensenten en redacteuren voor hun hulp om dit manuscript beter te maken.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
