24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें (EAgaL प्लेटें) का उपयोग कर एडीज एजिप्टी के लिए बेहतर Fecundity और प्रजनन परख
Summary
वर्णित एक समय और अंतरिक्ष की बचत विधि अंडे गिनती और 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर व्यक्तिगत मच्छरों की हैच दरों का निर्धारण है, जो काफी पैमाने और fecundity और प्रजनन क्षमता परख की गति में वृद्धि कर सकते हैं ।
Abstract
मच्छर विभिन्न रोगजनकों के वैक्टर के रूप में एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। उन अध्ययनों के लिए है कि मच्छर फिटनेस मापदंडों के आकलन की आवश्यकता है, विशेष रूप से अंडा उत्पादन और व्यक्तिगत स्तर पर हैच दरों में, पारंपरिक तरीकों उच्च श्रम तीव्रता और प्रयोगशाला अंतरिक्ष आवश्यकताओं के कारण जांचकर्ताओं पर एक महत्वपूर्ण बोझ डाल दिया है । वर्णित एक सरल विधि है जो प्रत्येक अच्छी तरह से और प्रत्येक अच्छी तरह से डिजिटल इमेजिंग में एगर उठे के साथ 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट का उपयोग करके काफी कम समय और अंतरिक्ष आवश्यकताओं के साथ एक व्यक्तिगत स्तर पर अंडे की संख्या और हैच दरों का निर्धारण करने के लिए है।
Introduction
वेक्टर जनित रोगजनकों से मनुष्यों की रक्षा के लिए मच्छरों का नियंत्रण एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य लक्ष्य है, मुख्य रूप से मच्छरों द्वारा किए गए अधिकांश रोगजनकों के लिए प्रभावी टीकों की कमी के कारण । कई अध्ययनों का उद्देश्य क्षेत्र में लागूजनसंख्या कटौती रणनीति1,2,3के साथ मिलकर मच्छरों की फिटनेस को कम करना है। इसमें ट्रांसजेनिक मच्छरों और/या CRISPR/Cas9 नॉकआउट लाइनों को बनाने के लिए व्यापक अध्ययन शामिल हैं । इस तरह के जनसंख्या संशोधन दृष्टिकोणों के लिए व्यक्तिगत फिटनेस मापदंडों का विस्तृत आकलनआवश्यकहै । मादा मच्छरों की फिटनेस का आकलन करने के लिए पारंपरिक प्रयोगशाला तकनीकों में 100 मिलीएल कंटेनरों में संभोग, रक्त-पोषित मादा मच्छरों की व्यक्तिगत रोकथाम शामिल है5,संशोधित 50 एमएल शंकु नली,या ड्रोसोफिला पालन के लिए ट्यूब, नम सतहों को ओसीपोजिशन (यानी अंडे के कागजात)1,2,6,7के लिए नम सतहों का उपयोग करके संशोधित किया गया है। इस तरह के तरीकों के लिए अपेक्षाकृत बड़ी जगह (उदाहरण के लिए, 30 सेमी x 30 सेमी x 10 सेमी: डब्ल्यू एक्स एल एक्स एच 100 ड्रोसोफिला ट्यूब)(चित्रा 1)तक की आवश्यकता होती है, और अंडे और हैचिंग लार्वा की गिनती के लिए व्यक्तिगत अंडे के कागजात में हेरफेर, जो श्रम गहन हो सकता है। यह पांडुलिपि मच्छरों के अंडों को गिनने और 24 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके हैच दरों का निर्धारण करने की एक विधि प्रस्तुत करता है और इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए एक ओविपोजिशन सतह के रूप में उठता है8.
समवर्ती, Ioshino एट अल9 एक विस्तृत विधि 12 और 24 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत महिलाओं से प्राप्त अंडे की गिनती प्रदर्शन वर्णित है । उनके प्रोटोकॉल में समय और स्थान9की बचत में पारंपरिक तरीकों से उल्लेखनीय सुधार का प्रतिनिधित्व किया गया । हालांकि, उनके द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल ओविपोजिशन के लिए एक सतह के रूप में गीले फिल्टर पेपर का उपयोग करना जारी रखता है, जिसके लिए प्रत्येक व्यक्तिगत पेपर को गिनती प्राप्त करने के लिए प्रकट करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि अंडे अक्सर नीचे या सिलवटों में पाए जाते हैं। उनके प्रोटोकॉल में इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग या लार्वा गिनती के लिए एक विधि भी शामिल नहीं थी।
प्रस्तुत अंडे की संख्या (यानी, fecundity) और हैच दर (यानी, प्रजनन क्षमता) के लिए फिटनेस परख प्रदर्शन करने के लिए एक बेहतर तरीका है एई के लिए एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट प्रारूप में एक अंडाशय सतह के रूप में agarose का उपयोग कर कि नम सतहों पर oviposit । इन प्लेटों को ईजीजी, आगागुलाब और एलअरवा से “ईएगल” प्लेटें नामित किया गया था। ये 24 अच्छी तरह से प्लेटें अंडे डालने के लिए एक न्यूनतम सतह के साथ व्यक्तिगत मच्छरों को प्रदान करती हैं, इस प्रकार कुछ दिनों के लिए अंडे और रची लार्वा को गिनने और बनाए रखने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को सरल और तेजी से कम करती हैं। ईएगल प्लेट ओविपोजिशन सतह के लिए पारदर्शी एगर उठे का उपयोग करती है, जो अंडे के कागजात को संभालने और अंडे और लार्वा खोजने की आवश्यकता को समाप्त करती है जब रची जाती है; प्रत्येक अच्छी तरह से फोटो खिंचवाने के परिणामों का एक दीर्घकालिक संग्रहीत रिकॉर्ड स्थापित करता है और पालन से दोनों समय और अंतरिक्ष में गिनती की प्रक्रिया को अलग/
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaL प्लेट एफटी विधि की तुलना में एडीज एजिप्टी में व्यक्तिगत fecundity और प्रजनन क्षमता का संचालन करने के लिए श्रम, समय और स्थान को काफी कम कर देती है। एफटी विधि और ईएएएल प्लेट के बीच प्रारंभिक तुलना के पर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वित्तपोषण के लिए टेक्सास एएंडएम एग्रीलाइफ रिसर्च कीट वेक्टर्ड डिजीज ग्रांट प्रोग्राम का शुक्रिया अदा करते हैं । हम पांडुलिपि का मसौदा तैयार करते समय इस विधि और सुझावों को विकसित करने में मदद के लिए एडेलमैन लैब के सदस्यों के साथ-साथ केविन माइल्स लैब के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। हम इस पांडुलिपि को बेहतर बनाने के लिए समीक्षकों और संपादकों को उनकी मदद के लिए भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
