Förbättrad fecundity och fertilitetsanalys för Aedes aegypti med hjälp av 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)
Summary
Beskrivet är en tids- och utrymmesbesparande metod för att räkna ägg och bestämma kläckningshastigheter för enskilda myggor med hjälp av 24 brunnsvävnadskulturplattor, vilket avsevärt kan öka omfattningen och hastigheten på fecundity och fertilitetsanalyser.
Abstract
Myggor utgör ett betydande folkhälsoproblem som vektorer av olika patogener. För de studier som kräver en bedömning av parametrar för myggkondition, särskilt äggproduktion och kläckningshastigheter på individnivå, har konventionella metoder lagt en betydande börda på utredarna på grund av hög arbetsintensitet och laboratorieutrymmeskrav. Beskrivet är en enkel metod med 24 brunnsvävnadskulturplatta med agarosa i varje brunn och digital avbildning av varje brunn för att bestämma äggnummer och kläckhastigheter på individnivå med väsentligt reducerade tids- och utrymmeskrav.
Introduction
Kontroll av myggor för att skydda människor från vektorburna patogener är ett viktigt folkhälsomål, främst på grund av bristen på effektiva vacciner för de flesta patogener som bärs av myggor. Många studier syftar till att minska myggans kondition i samband med en fält tillämplig befolkningsminskningsstrategi1,2,3. Detta inkluderar omfattande studier för att skapa transgena myggor och / eller CRISPR / Cas9 knockout linjer. Sådana metoder för befolkningsförändringar kräver en detaljerad bedömning av individuella parametrar för ändamålsenligitet4. Konventionella laboratorietekniker för att bedöma kvinnliga myggors kondition inkluderar individuell inneslutning av parade, blodmatade kvinnliga myggor i 100 ml behållare5, modifierade 50 ml koniska rör eller rör för Drosophila-uppfödning modifierad genom att tillhandahålla fuktiga ytor med fuktig bomull och filterpappersskivor för oviposition (dvs. äggpapper)1,2,6,7. Sådana metoder kräver ett relativt stort utrymme (t.ex. 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H för upp till 100 Drosophila-rör) (Figur 1), och manipulering av enskilda äggpapper för att räkna ägg och kläckningslarver, vilket kan vara arbetsintensivt. Detta manuskript presenterar en metod för att räkna myggägg och bestämma kläckningshastigheter med 24 brunnsplattor och agarosa som en ovipositionsyta för att kringgå dessa problem8.
Samtidigt beskrev Ioshino et al.9 en detaljerad metod med hjälp av 12 och 24 brunnsplattor för att utföra äggräkning som erhållits från enskilda honor. Deras protokoll representerade en betydande förbättring från konventionella metoder för att spara tid och utrymme9. Protokollet de beskrev fortsätter dock att använda våtfilterpapper som en yta för oviposition, vilket kräver att man vecklar ut varje enskilt papper för att få räkningar, eftersom ägg ofta finns under eller i veck. Deras protokoll inkluderade inte heller användning av bildteknik eller en metod för larvräkning.
Presenteras är en förbättrad metod för att utföra konditionsanalyser för äggnummer (dvs. fecundity) och kläckhastighet (dvs. fertilitet) med agarose som en oviposition yta i ett 24 brunnsvävnad kulturplåt format för Ae. aegypti att oviposit på fuktiga ytor. Dessa plåtar kallades “EAgaL” plattor, från Egg, Agarose och Larva. Dessa 24 brunnstallrikar ger enskilda myggor en minimal yta för att lägga ägg, vilket förenklar och drastiskt minskar den tid och ansträngning som krävs för att räkna och underhålla ägg och kläckta larver i några dagar. EAgaL-plattan använder genomskinlig agarosa för ovipositionsytan, vilket eliminerar behovet av att hantera äggpapper och hitta ägg och larver när de kläcks; Att fotografera varje brunn upprättar en långsiktig arkiverad post över resultaten och skiljer räkningsprocessen i både tid och rum från uppfödnings-/hanteringsprocessen, där tiden ofta är begränsad.
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaL-plattan minskar drastiskt arbete, tid och utrymme för att utföra individuella fecundity- och fertilitetsanalyser i Aedes aegypti jämfört med FT-metoden. Den preliminära jämförelsen mellan FT-metoden och EAgaL-plattan resulterade i kortare tider för alla steg (bildteknik tillämpades på FT-metoden) (tabell 1). Som referens anges en uppskattning av start- och per analyskostnader (en 24-brunns EAgaL-platta jämfört med 24 FT) i tabell 2.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program för finansiering. Vi tackar också Adelman lab-medlemmarna för hjälp med att utveckla denna metod och förslag när manuskriptet utarbetas, liksom Kevin Myles labbmedlemmar. Vi tackar också recensenter och redaktörer för deras hjälp att göra detta manuskript bättre.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
