Methylation محددة متعددة القطرية PCR باستخدام بوليمر جهاز مولد قطرة لتشخيص الدم
Summary
وتستخدم علامات اللاجينية لخلايا الدم البيضاء (WBC) subtyping من خلال القياس الكمي للأنماط المثيلة الحمض النووي. يقدم هذا البروتوكول طريقة تفاعل سلسلة البوليمرات القطرة المتعددة (mdPCR) باستخدام جهاز مرقّم حراري (TPE) قائم على microfluidic لتوليد القطرات مما يسمح بالتخصيص الكمي الدقيق والمضاعف للميثيل المحدد للعد التفاضلي WBC.
Abstract
ويرد وصف لسير عمل متعدد التكرار (mdPCR) وبروتوكول مفصل لتحديد الخلايا الدم البيضاء المستندة إلى اللاجينية (WBC) تفاضلية، جنبا إلى جنب مع مولد الدران الحراري (TPE) microfluidic جيل الجهاز. وتستخدم علامات اللاجينية لcC subtyping الذي هو من قيمة التكهن الهامة في أمراض مختلفة. ويتحقق ذلك من خلال القياس الكمي لأنماط المثيلات بالحمض النووي لمناطق معينة غنية بـ CG في الجينوم (Cpg loci). في هذه الورقة، يتم تغليف الحمض النووي المعالج بالثنائية الفقار من خلايا الدم أحادية النوى الطرفية (PBMCs) في قطرات مع كواشف mdPCR بما في ذلك الاعوئ والمسبارات الفلورية التحللية المائية المحددة لـ Cpg loci التي ترتبط مع مجموعات السكان الفرعية WBC. ويسمح نهج تعدد الخواص باستجواب العديد من مراكز Cpg loci دون الحاجة إلى تفاعلات منفصلة من المعالجة بالنظم المتعددة البروم في المواد الكيميائية، مما يتيح تحديد أكثر دقة للسكان شبه المحيطيين باستخدام التحليل اللاجيني لمواقع المثيل. ويمكن توسيع نطاق هذا القياس الكمي الدقيق إلى تطبيقات مختلفة ويسلط الضوء على فوائد التشخيص السريري والتكهن اللاحق.
Introduction
تحليل تكوين خلايا الدم البيضاء (WBCs) هو من بين الاختبارات المختبرية المطلوبة في كثير من الأحيان في التشخيص الدموي. يعتبر عدد الكريات البيض التفاضلي بمثابة مؤشر لطائفة من الأمراض بما في ذلك العدوى والالتهابات وفقر الدم وسرطان الدم ، وهو قيد التحقيق كعلامة بيولوجية تنبؤية مبكرة للعديد من الحالات الأخرى أيضًا. معيار الذهب في شرك WBC ينطوي على مناعة و / أو تدفق استئصال الدراجات على حد سواء التي تتطلب مكلفة، غير استقرار الأجسام المضادة الفلورية، وغالبا ما تعتمد اعتمادا كبيرا على كفاءة المشغل في إعداد العينة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة تنطبق على عينات الدم الطازجة فقط، بحيث لا يمكن تجميد العينات للشحن أو التحليل اللاحق.
ظهرت مؤخراً علامات اللاجينية كأدوات تحليلية قوية لدراسة الاختلافات الظاهرية. وفي وقت لاحق، تبين أن مجموعات الكريات البيض البشرية لديها أنماط لتلوين الحمض النووي لخلايا تسمح بالتأسم الدقيق للمجموعات الفرعية للWBC. subtyping على أساس علامات اللاجينية يوفر بديلا واعدا لا يعتمد على جمع عينة الدم الطازجة أو الأجسام المضادة باهظة الثمن ويمكن استغلالها كعلامة حيوية لظهور المرض والحساسية1،2،3،4،5.
وقد أجريت دراسات على نطاق الجينوم من أجل رسم خرائط واسعة النطاق لمناطق محددة ميثيلية من المناطق الغنية بـ CG في الجينوم (جزر Cpg) في أنواع فرعية من الكريات البيض لتحديد علامات اللاجينية المرشحة الخاصة بالأنماط الفرعية الكريات البيض. وقد تم تطوير بروتوكولات PCR لهذا السبب لمناطق الجينات الميثيلية، مثل CD3Z و FOXP3، المقابلة لـ CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ الخلايا T-التنظيمية (T-Regs) على التوالي. وقد أظهرت Wiencke وآخرون فائدة من الوتير PCR مزدوجة من أجل subtyping اللاجينية من الخلايا T، مما أسفر عن نتائج التي ترتبط ارتباطا كبيرا مع تدفق الخلايا النشطة الفرز (FACS) تحليل6. تعتمد طريقة التحليل الجيني الكمي هذه على تقسيم جزيئات الحمض النووي القالب والكواشف PCR إلى آلاف من منفصلة، الحجمية المعرفة، دون نانولتر الحجم قطرات الحجم التي تحتوي على صفر، واحد أو أكثر من النسخ الحمض النووي الهدف، وذلك باستخدام مستحلبات المياه في النفط التي مكنها microfluidics7،8. ويتم إجراء تضخيم PCR داخل كل قطرة على حدة ويتم قياس شدة الفلورية نقطة النهاية لكل قطرة، مما يسمح بالتقمّد الكمي المطلق للأهداف الموجودة في العينة. وقد تم إنشاء القطيرة PCR لتكون أكثر دقة ودقة، وأبسط من الناحية الفنية من qPCR القياسية، مما يجعلها أكثر ملاءمة الحمض النووي على أساس طريقة القائمة على التقييم السريري للخلايا T. على الرغم من أن منهجية فرعية الناشئة بسرعة ، وتحليل متعدد اللاجينية للتحقيق لمختلف المناطق Cpg الميثيلية في وقت واحد غير موجود. وهذا ضروري للعد التفاضلي الكريات البيض الروتينية.
هنا، يتم تقديم جهاز ميكروفلورويديك ميكروفلورويدي للبلاستيك اللدائن الحرارية (TPE) واستخدامها في وحدات PCR متعددة الوميضات الخاصة بالميثيل (mdPCR). وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتحديد أنواع فرعية معينة من الكريات البيض، CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ T-Regs، استناداً إلى أنماط صبغة الحمض النووي الخلوي، أي التباين اللاجيني لمناطق CD3Z وFOXP3 CpG على التوالي. يوصف بروتوكول مفصل لاستخراج الحمض النووي وتحويل البيسولفيت وmdPCR بالتنسيق مع طريقة تصنيع لجهاز توليد قطرات TPE. وتقارن النتائج التمثيلية لهذه الطريقة بنتائج تلطيخ الفلوروس المناعي الذي يبرز فائدة النهج المقترح.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول التجريبي المعروض والأساليب تسمح لdPCR في المنزل باستخدام مولد قطرات TPE ملفقة، ودورة حرارية، والمجهر الفلورانس. الجهاز ملفقة باستخدام TPE لينة إلى TPE الترابط يتيح خصائص سطح الماء التي هي موحدة عبر جميع جدران القناة، بحيث الجهاز النهائي لا يتطلب أي معالجة السطح للاستخدام اللاحق كمو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويقر المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المجلس الوطني للبحوث في كندا.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. . The Autoimmune Diseases. , (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
