Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR
Summary
Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.
Abstract
Çok katlı damlacık PCR (mdPCR) iş akışı ve epigenetik tabanlı beyaz kan hücresi (WBC) diferansiyel sayımının belirlenmesi için ayrıntılı protokol, termoplastik elastomer (TPE) mikroakışkan damlacık üretim cihazı ile birlikte tanımlanmıştır. Epigenetik belirteçler farklı hastalıklarda önemli prognostik değeri olan WBC subtyping için kullanılır. Bu, genomdaki (CpG loci) belirli CG açısından zengin bölgelerin DNA metilasyon paternlerinin ölçülmesi ile elde edilir. Bu yazıda, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMCs) bisülfit le tedavi DNA’ sı, WBC alt popülasyonları ile ilişkili CpG loci’ne özgü astarlar ve hidroliz floresan probları da dahil olmak üzere mdPCR reaktifleri ile damlacıklarda kapsüllenmiştir. Multipleks yaklaşımı, ayrı mdPCR reaksiyonlarına gerek kalmadan birçok CpG loci’nin sorgulanmasını sağlayarak, metilasyon alanlarının epigenetik analizini kullanarak WBC alt popülasyonlarının daha doğru parametrik belirlenmesini sağlar. Bu kesin nicelik farklı uygulamalara genişletilebilir ve klinik tanı ve sonraki prognoz için yararları vurgulamaktadır.
Introduction
Beyaz kan hücreleri (WBCs) bileşiminin analizi hematolojik tanılarda en sık istenen laboratuvar testleri arasındadır. Diferansiyel lökosit sayısı enfeksiyon, inflamasyon, anemi ve lösemi gibi hastalıkların bir spektrum için bir gösterge olarak hizmet vermektedir, ve diğer birçok durum için erken prognostik biyomarker olarak soruşturma altında da. WBC subtyping altın standart immünboyama ve / veya akış sitometri her ikisi de pahalı gerektiren içerir, kararsızlığa eğilimli floresan antikorlar ve genellikle son derece örnek hazırlanmasında operatör yeterlilik bağlıdır. Ayrıca, bu yöntem sadece taze kan örnekleri için geçerlidir, böylece numuneler sevkiyat veya daha sonra analiz için dondurulamaz.
Epigenetik belirteçler son zamanlarda fenotibik varyasyonların incelenmesi için güçlü analitik araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Daha sonra, insan lökosit popülasyonları WBC alt kümelerinin kesin karakterizasyonu için izin hücre soyundan DNA metilasyon desenleri olduğu gösterilmiştir. Epigenetik belirteçlere dayalı subtipleme taze kan örneği toplama veya pahalı antikorlar bağlı değildir ve hastalık başlangıcı ve duyarlılık1,2,,3,4,5için bir biyomarker olarak istismar edilebilir umut verici bir alternatif sağlar.
Lökosit alt tiplerinde genom (CpG adaları) metillenmiş spesifik CG açısından zengin bölgelerin lökosit alt tiplerine özgü aday epigenetik belirteçleri belirlemek için genomda (CpG adaları) kapsamlı haritalama çalışmaları yapılmıştır. PCR protokolleri, cd3+ T-Cells ve CD4+ CD25+ Regulatory T-Cells (T-Regs) ile karşılık gelen metilasyonlu gen bölgeleri, örneğin CD3Z ve FOXP3 için bu nedenle geliştirilmiştir. Wiencke ve ark. T-Hücrelerinin epigenetik subtyping için dupleks damlacık PCR yarar göstermiştir, son derece akış aktif hücre sıralama (FACS)analizi6 ile ilişkili sonuçlar elde . Bu kantitatif genetik analiz yöntemi, şablon nükleik asit molekülleri ve PCR reaktiflerinin mikroakışkanlar tarafından etkin leştirilmiş su-in-oil emülsiyonları kullanılarak sıfır, bir veya daha7,fazla hedef nükleik asit kopyaları içeren binlerce ayrık, hacimsel olarak tanımlanmış, nanolitre altı boyutlu damlacıklara bölünmesinedayanır. PCR amplifikasyon her bir damlacık içinde gerçekleştirilir ve her damlacık uç nokta floresan yoğunluğu ölçülür, örnekmevcut hedeflerin mutlak nicelik sağlar. Damlacık PCR standart qPCR daha hassas, doğru ve teknik olarak basit olarak kurulmuştur, T-Hücrelerinin klinik değerlendirilmesi için daha olumlu bir DNA metilasyon tabanlı yöntem yapma. Hızla ortaya çıkan bir alt tipleme metodolojisi olmasına rağmen, aynı anda çeşitli metillenmiş CpG bölgeleri için araştırmak için çok katlı epigenetik analiz eksiktir. Bu rutin lökosit diferansiyel sayımları için gereklidir.
Burada, bir termoplastik elastomer (TPE) damlacık mikroakışkan cihaz sunulmaktadır ve metilasyona özgü multipleks damlacık PCR (mdPCR) için istihdam. Bu teknoloji, hücre soyundan dna metilasyon desenlerine, yani CD3Z ve FOXP3 CpG bölgelerinin epigenetik varyasyonuna göre spesifik lökosit alt tipleri, CD3+ T-Cells ve CD4+ CD25+ T-Regs’i belirlemek için kullanılmıştır. DNA ekstraksiyonu, bisülfit dönüşümü ve mdPCR için ayrıntılı bir protokol, TPE damlacık üretim cihazı için bir üretim yöntemi ile uyumlu olarak tanımlanmıştır. Yöntemin temsili sonuçları, önerilen yaklaşımın yararını vurgulayan immünoresans boyama sonuçlarıyla karşılaştırılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan deneysel protokol ve yöntemler, fabrikasyon TPE damlacık jeneratörü, termal çevrimleyici ve floresan mikroskobu kullanarak şirket içi mdPCR’ye olanak sağlar. TPE yapıştırma yumuşak TPE kullanarak fabrikasyon cihaz tüm kanal duvarları boyunca düzgün hidrofobik yüzey özellikleri sağlar, bu nedenle son cihaz bir damlacık jeneratör olarak sonraki kullanım için herhangi bir yüzey işleme gerektirmez. Bu malzeme rutin yüksek iş üretimi9,10,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Kanada Ulusal Araştırma Konseyi mali destek kabul.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. . The Autoimmune Diseases. , (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
