Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik
Summary
Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.
Abstract
Ein Multiplex-Droplet-PCR-Workflow (mdPCR) und ein detailliertes Protokoll zur Bestimmung der epigenetischen Anzahl von weißen Blutkörperchen (WBC) werden zusammen mit einem thermoplastischen Elastomer (TPE) mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungsgerät beschrieben. Epigenetische Marker werden für die WBC-Subtypisierung verwendet, die bei verschiedenen Krankheiten von wichtigem prognostischen Wert ist. Dies wird durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern bestimmter CG-reicher Regionen im Genom (CpG loci) erreicht. In diesem Beitrag wird bisulfitbehandelte DNA aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in Tröpfchen mit mdPCR-Reagenzien, einschließlich Primern und hydrolysefluoreszierenden Sonden, die speziell für CpG-Loci sind, die mit WBC-Subpopulationen korrelieren, eingekapselt. Der Multiplex-Ansatz ermöglicht die Abfrage vieler CpG-Loci ohne separate mdPCR-Reaktionen, was eine genauere parametrische Bestimmung von WBC-Subpopulationen mithilfe epigenetischer Analysen von Methylierungsstellen ermöglicht. Diese präzise Quantifizierung kann auf verschiedene Anwendungen ausgedehnt werden und hebt die Vorteile für die klinische Diagnose und die anschließende Prognose hervor.
Introduction
Die Analyse der Zusammensetzung weißer Blutkörperchen (WBCs) gehört zu den am häufigsten nachgefragten Labortests in der hämatologischen Diagnostik. Differential-Leukozyten-Zahl dient als Indikator für ein Spektrum von Krankheiten einschließlich Infektion, Entzündung, Anämie, und Leukämie, und wird als frühe prognostische Biomarker für mehrere andere Bedingungen sowie untersucht. Der Goldstandard in der WBC-Subtypisierung beinhaltet Immunfärbung und/oder Durchflusszytometrie, die beide kostspielige, instabil-anfällige fluoreszierende Antikörper erfordern und oft stark von der Befähigung des Bedieners in der Probenvorbereitung abhängig sind. Darüber hinaus gilt diese Methode nur für frische Blutproben, so dass die Proben nicht für den Versand oder die spätere Analyse eingefroren werden können.
Epigenetische Marker haben sich in letzter Zeit als leistungsfähige Analysewerkzeuge für die Untersuchung von phänotypischen Variationen herausgestellt. In der Folge wurde gezeigt, dass menschliche Leukozytenpopulationen DNA-Methylierungsmuster für Zelllinien aufweisen, die eine präzise Charakterisierung von WBC-Teilmengen ermöglichen. Subtypisierung auf Basis epigenetischer Marker bietet eine vielversprechende Alternative, die nicht von der Entnahme von frischer Blutprobe oder teuren Antikörpern abhängt und als Biomarker für Krankheitsbeginn und Anfälligkeit1,2,3,4,5” genutzt werden kann.
Genomweite Studien wurden für die umfassende Kartierung methylierter spezifischer CG-reicher Regionen im Genom (CpG-Inseln) in Leukozytensubtypen durchgeführt, um epigenetische Kandidatenmarker zu identifizieren, die für Leukozytensubtypen spezifisch sind. PCR-Protokolle wurden aus diesem Grund für methylierte Genregionen entwickelt, z.B. CD3Z und FOXP3, entsprechend CD3+ T-Cells und CD4+ CD25+ Regulatory T-Cells (T-Regs). Wiencke et al. haben die Nützlichkeit der Duplex-Tropfen-PCR für die epigenetische Subtypisierung von T-Zellen nachgewiesen und ergebnissegebracht, die in hohem Maße mit der durchflussaktivierten Zellsortierung (FACS) Korpusanalyse korrelieren6. Diese quantitative genetische Analysemethode beruht auf der Aufteilung der Schablonennukleinsäuremoleküle und PCR-Reagenzien in Tausende von diskreten, volumetrisch definierten Tröpfchen mit Null, einer oder mehreren Zielnukleinsäurekopien, mit Wasser-in-Öl-Emulsionen, die durch Mikrofluidika aktiviert werden7,8. Die PCR-Verstärkung wird in jedem einzelnen Tröpfchen durchgeführt und die Endpunktfluoreszenzintensität jedes Tröpfchens wird gemessen, so dass eine absolute Quantifizierung der in der Probe vorhandenen Ziele möglich ist. Droplet PCR wurde etabliert, um präziser, genauer und technisch einfacher als Standard qPCR zu sein, was es zu einer günstigeren DNA-Methylierungs-basierten Methode für die klinische Bewertung von T-Cells macht. Obwohl eine sich rasch entwickelnde Subtypisierungsmethode fehlt, fehlt es an multiplexed epigenetischen Analysen, um verschiedene methylierte CpG-Regionen gleichzeitig zu untersuchen. Dies ist für routinemäßige Leukozytendifferenzzählungen notwendig.
Hierbei wird ein thermoplastisches Elastomer (TPE) Tröpfchen-Mikrofluid-Gerät vorgestellt und für methylierungsspezifische Multiplex-Tröpfchen-PCR (mdPCR) eingesetzt. Die Technologie wurde verwendet, um spezifische Leukozyten-Subtypen, CD3+ T-Cells und CD4+ CD25+ T-Regs, basierend auf Zelllinien-DNA-Methylierungsmustern, d.h. epigenetischen Variationen von CD3Z- bzw. FOXP3 CpG-Regionen, zu definieren. Ein detailliertes Protokoll zur DNA-Extraktion, Bisulfitumwandlung und mdPCR wird in Abstimmung mit einer Herstellungsmethode für ein TPE-Tröpfchenerzeugungsgerät beschrieben. Repräsentative Ergebnisse der Methode werden mit denen der Immunfluoreszenzfärbung verglichen, die den Nutzen des vorgeschlagenen Ansatzes unterstreicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte experimentelle Protokoll und die vorgestellten Methoden ermöglichen die hauseigene mdPCR mit einem hergestellten TPE-Tröpfchengenerator, einem thermischen Cycler und einem Fluoreszenzmikroskop. Das hergestellte Gerät mit weicher TPE-zu-TPE-Bindung bietet hydrophobe Oberflächeneigenschaften, die über alle Kanalwände gleichmäßig sind, so dass das Endgerät keine Oberflächenbehandlung für die spätere Verwendung als Tröpfchengenerator erfordert. Dieses Material wurde routinemäßig in Point-of-Ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch den National Research Council of Canada.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
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