Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics
Summary
Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.
Abstract
Un flux de travail de PCR de gouttelette multiplexe (mdPCR) et un protocole détaillé pour déterminer le nombre différentiel de globules blancs épigénétiques (WBC) sont décrits, ainsi qu’un dispositif thermoplastique de génération de gouttelettes d’élastomère (TPE). Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-typage WBC qui est d’une valeur pronostique importante dans différentes maladies. Ceci est réalisé par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN de régions spécifiques riches en CG dans le génome (CpG loci). Dans cet article, l’ADN traité en bisulfite provenant de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) est encapsulé dans des gouttelettes avec des réactifs mdPCR, y compris des amorces et des sondes fluorescentes d’hydrolyse spécifiques aux loci cpg qui sont en corrélation avec les sous-populations WBC. L’approche multiplexe permet l’interrogatoire de nombreux loci CpG sans avoir besoin de réactions mdPCR séparées, permettant une détermination paramétrique plus précise des sous-populations WBC à l’aide de l’analyse épigénétique des sites de méthylation. Cette quantification précise peut être étendue à différentes applications et met en évidence les avantages pour le diagnostic clinique et le pronostic suivant.
Introduction
L’analyse de la composition des globules blancs (CWB) est l’un des tests de laboratoire les plus fréquemment demandés dans le diagnostic hématologique. Le nombre différentiel de leucocytes sert d’indicateur pour un spectre de maladies comprenant l’infection, l’inflammation, l’anémie, et la leucémie, et est sous l’étude en tant que biomarqueur pronostique tôt pour plusieurs autres conditions aussi bien. L’étalon-or dans le sous-typage WBC implique l’immunostaining et/ou la cytométrie de flux qui exigent des anticorps fluorescents coûteux et sujets à l’instabilité et sont souvent fortement dépendants de la compétence de l’opérateur dans la préparation de l’échantillon. En outre, cette méthode ne s’applique qu’aux échantillons de sang frais, de sorte que les échantillons ne peuvent pas être congelés pour l’expédition ou l’analyse ultérieure.
Les marqueurs épigénétiques ont récemment émergé comme de puissants outils d’analyse pour l’étude des variations phénotypiques. Par la suite, il a été démontré que les populations de leucocytes humains avaient des modèles de méthylation de l’ADN de lignée cellulaire qui permettent la caractérisation précise des sous-ensembles WBC. Le sous-texte basé sur des marqueurs épigénétiques offre une alternative prometteuse qui ne dépend pas de la collecte d’échantillons de sang frais ou d’anticorps coûteux et peut être exploité comme biomarqueur pour l’apparition de la maladie et la susceptibilité1,2,3,4,5.
Des études à l’échelle du génome ont été réalisées pour une cartographie approfondie des régions spécifiques méthylées riches en CG dans le génome (îles CpG) dans des sous-types de leucocytes afin d’identifier les marqueurs épigénétiques candidats spécifiques aux sous-types de leucocytes. Des protocoles PCR ont été développés en raison de cette raison pour les régions de gènes méthylés, par exemple, CD3Z et FOXP3, correspondant à CD3+ T-Cells et CD4+ CD25+ T-Cells régulateurs (T-Regs), respectivement. Wiencke et coll. ont démontré l’utilité de la gouttelette duplex PCR pour le sous-typage épigénétique des lymphocytes T, donnant des résultats qui sont fortement corrélés avec l’analyse de tri cellulaire activée par flux (FACS)6. Cette méthode d’analyse génétique quantitative repose sur la partition des molécules d’acide nucléique de modèle et des réactifs PCR en milliers de gouttelettes discrètes, définies de façon volumétrique et sous-nanolitres contenant zéro, une ou plusieurs copies d’acide nucléique cible, à l’aide d’émulsions d’eau dans l’huile activées par microfluidiques7,8. L’amplification du PCR est effectuée dans chaque gouttelette individuelle et l’intensité de fluorescence du point d’évaluation de chaque gouttelette est mesurée, ce qui permet une quantification absolue des cibles présentes dans l’échantillon. Droplet PCR a été établi pour être plus précis, précis, et techniquement plus simple que qPCR standard, ce qui en fait une méthode plus favorable à base de méthylation de l’ADN pour l’évaluation clinique des lymphocytes T. Bien qu’une méthodologie de sous-tage émerge rapidement, l’analyse épigénétique multiplexée pour sonder pour diverses régions méthylées de CpG manque simultanément. Ceci est nécessaire pour les comptes différentiels de leucocytes de routine.
Ici, un dispositif microfluidique de gouttelette thermoplastique d’élastomère (TPE) est présenté et employé pour la mélilation spécifique à la gouttelette multiplexe PCR (mdPCR). La technologie a été utilisée pour délimiter des sous-types spécifiques de leucocytes, CD3+ T-Cells et CD4+ CD25+ T-Regs, basés sur des modèles de méthylation de l’ADN de lignée cellulaire, c’est-à-dire la variation épigénétique des régions CD3Z et FOXP3 CpG, respectivement. Un protocole détaillé pour l’extraction de l’ADN, la conversion de bisulfite et le mdPCR est décrit de concert avec une méthode de fabrication pour un dispositif de génération de gouttelettes de TPE. Les résultats représentatifs de la méthode sont comparés à ceux de la coloration d’immunofluorescence soulignant l’utilité de l’approche proposée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole et les méthodes expérimentaux présentés permettent le mdPCR interne à l’aide d’un générateur de gouttelettes TPE fabriqué, d’un cycleur thermique et d’un microscope à fluorescence. L’appareil fabriqué utilisant le TPE doux au collage TPE offre des propriétés de surface hydrophobes qui sont uniformes sur tous les murs du canal, de sorte que le dispositif final ne nécessite aucun traitement de surface pour une utilisation ultérieure comme générateur de gouttelettes. Ce matériel a ét…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’appui financier du Conseil national de recherches du Canada.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. . The Autoimmune Diseases. , (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
