ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR
Summary
エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。
Abstract
多重液滴PCR(mdPCR)ワークフローとエピジェネティックベースの白血球(WBC)微分カウントを決定するための詳細なプロトコルが、熱可塑性エラストマー(TPE)マイクロ流体液滴生成装置と共に記載されている。エピジェネティックマーカーは、異なる疾患における重要な予後値であるWBCサブタイピングに使用されます。これは、ゲノム中の特定のCGリッチ領域(CpG loci)のDNAメチル化パターンの定量化を通じて達成される。本論文では、末梢血単核細胞(PBMCs)の亜硫酸水素塩処理DNAを、WBC亜集団と相関するCpG遺伝子座に特異的なプライマーおよび加水分解蛍光プローブを含むmdPCR試薬を用いて液滴に封入する。マルチプレックスアプローチは、別々のmdPCR反応を必要とせずに多くのCpG遺伝子座の尋問を可能にし、メチル化部位のエピジェネティック解析を用いたWBC亜集団のより正確なパラメトリック決定を可能にする。この精密な定量はさまざまな適用に拡張することができ、臨床診断とその後の予後のための利点を強調する。
Introduction
白血球(WbCs)組成物の分析は、血液学的診断において最も頻繁に要求される検査検査の一つです。▲微分白血球数は、感染症、炎症、貧血、白血病などの疾患のスペクトルの指標として機能し、他のいくつかの条件の初期予後バイオマーカーとして調査中である。WBCサブタイピングにおけるゴールドスタンダードは、高価で不安定な蛍光抗体を必要とする免疫染色および/またはフローサイトメトリーを含み、サンプル調製におけるオペレータの熟練度に大きく依存することが多い。さらに、この方法は、出荷または後の分析のためにサンプルを凍結することができないような新鮮な血液サンプルにのみ適用されます。
エピジェネティックマーカーは、表現型のバリエーションの研究のための強力な分析ツールとして最近登場しています。その後、ヒト白血球集団は、WBCサブセットの正確な特徴付けを可能にする細胞系DNAメチル化パターンを有することが示されている。エピジェネティックマーカーに基づくサブタイプは、新鮮な血液サンプル採取や高価な抗体に依存せず、疾患発症および感受性11、2、3、4、52,のバイオマーカーとして利用できる有望な代替手段を提供する。3,4,5
ゲノムワイド研究は、白血球サブタイプにおけるゲノム(CpG島)におけるメチル化された特定のCGリッチ領域の広範なマッピングに対して行われ、白血球サブタイプに特異的なエピジェネティックマーカー候補を同定する。PCRプロトコルは、メチル化遺伝子領域、例えばCD3ZおよびFOXP3、CD3+T細胞およびCD4+CD25+調節性T細胞(T-Regs)+にそれぞれ対応する理由から開発された。Wienckeらは、T細胞のエピジェネティックサブタイピングに対する二重液滴PCRの有用性を実証し、フロー活性化細胞選別(FACS)解析6と高い相関を持つ結果を生じる。この定量的遺伝子解析法は、鋳型核酸分子およびPCR試薬を、マイクロ流体によって可能,な油中水乳液を用いて、ゼロ、1つ以上の標的核酸コピーを含む数千個の離散、体積的に定義されたサブナノリットルサイズの液滴に分割することに依存している。PCR増幅は、個々の液滴内で行われ、各液滴のエンドポイント蛍光強度が測定され、サンプル中に存在する標的の絶対定量が可能となる。液滴PCRは、標準のqPCRよりも正確で正確で技術的に簡単なように確立されており、T細胞の臨床評価に適したDNAメチル化ベースの方法となっています。急速に出現するサブタイピング方法論であるものの、様々なメチル化CpG領域を同時に探査するエピジェネティック解析の多重化は欠けている。これは、定期的な白血球の差動度数に必要です。
本明細書において、熱可塑性エラストマー(TPE)液滴微小流体装置が提示され、メチル化特異的多重液滴PCR(mdPCR)に用いられた。この技術は、細胞系DNAメチル化パターン、すなわちCD3ZおよびFOXP3 CpG領域のエピジェネティック変異に基づいて、特定の白血球サブタイプ、CD3+T細胞およびCD4+CD25+T-Regsをそれぞれ説明するために使用されてきた。+ +DNA抽出、亜硫酸水素変換およびmdPCRのための詳細なプロトコルは、TPE液滴生成装置の製造方法と協調して説明される。この方法の代表的な結果は、提案されたアプローチの有用性を強調する免疫蛍光染色のものと比較される。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された実験的なプロトコルおよび方法は作られたTPEの液滴発生器、熱サイクラーおよび蛍光顕微鏡を使用して社内mdPCRを可能にする。柔らかいTPEからTPEへの結合を使用して製造された装置は、最終的な装置が液滴発生器としてその後使用するために表面処理を必要としないように、すべてのチャネル壁にわたって均一である疎水性表面特性を与える。この材料は、高スループット製造…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、カナダ国立研究評議会からの財政的支援を認めている。
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
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