मिथाइलेशन विशिष्ट मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर हेमेटोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स के लिए पॉलीमर ड्रॉपलेट जेनरेटर डिवाइस का उपयोग कर
Summary
एपिजेनेटिक मार्कर का उपयोग डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न के क्वांटिफिकेशन के माध्यम से सफेद रक्त कोशिका (डब्ल्यूबीसी) उपकरण के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (एमडीपीसीआर) विधि को थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (टीपीई) आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके प्रस्तुत करता है जो ड्राइल जेनरेशन के लिए सटीक और मल्टीप्लेक्स मिथाइलेशन-विशिष्ट लक्ष्य क्वांटिफिकेशन के लिए अनुमति देता है।
Abstract
थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (टीपीई) माइक्रोफ्लुइड ड्रॉपलेट जनरेशन डिवाइस के साथ-साथ एपिजेनेटिक बेस्ड वाइट ब्लड सेल (डब्ल्यूबीसी) डिफरेंशियल काउंट का निर्धारण करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर (एमडीपीसीआर) वर्कफ्लो और विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । एपिजेनेटिक मार्कर का उपयोग डब्ल्यूबीसी उपलेखन के लिए किया जाता है जो विभिन्न रोगों में महत्वपूर्ण शकुन मूल्य का है। यह जीनोम (सीपीजी लोकी) में विशिष्ट सीजी-समृद्ध क्षेत्रों के डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न के परिमाणीकरण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। इस पत्र में, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से बिसल्फी-उपचारित डीएनए को एमडीपीसीआर रिएजेंट्स के साथ बूंदों में समझाया जाता है जिसमें प्राइमर और हाइड्रोलिसिस फ्लोरोसेंट जांच शामिल है जो डब्ल्यूबीसी उप-आबादी के साथ सहसंबंधित है। मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण अलग एमडीपीसीआर प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता के बिना कई सीपीजी लोकी से पूछताछ के लिए अनुमति देता है, जिससे मिथाइलेशन साइटों के एपिजेनेटिक विश्लेषण का उपयोग करके डब्ल्यूबीसी उप-आबादी का अधिक सटीक पैरामेट्रिक निर्धारण सक्षम होता है। इस सटीक मात्राकरण को विभिन्न अनुप्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है और नैदानिक निदान और बाद में पूर्वानुमान के लाभों पर प्रकाश डाला गया है।
Introduction
सफेद रक्त कोशिकाओं (WBCs) संरचना का विश्लेषण हीमेटोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स में सबसे अधिक बार अनुरोध किए गए प्रयोगशाला परीक्षणों में से एक है। अंतर ल्यूकोसिटे गिनती संक्रमण, सूजन, एनीमिया, और ल्यूकेमिया सहित रोगों के एक स्पेक्ट्रम के लिए एक संकेतक के रूप में कार्य करता है, और कई अन्य स्थितियों के लिए एक प्रारंभिक शकुन बायोमार्कर के रूप में भी जांच के अधीन है। डब्ल्यूबीसी सबटाइपिंग में गोल्ड स्टैंडर्ड में इम्यूनोदाता और/या फ्लो साइटोमेट्री शामिल है जिनमें से दोनों को महंगा, अस्थिरता-प्रवण फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है और अक्सर नमूना तैयार करने में ऑपरेटर प्रवीणता पर अत्यधिक निर्भर होते हैं । इसके अलावा, यह विधि केवल ताजा रक्त नमूनों पर लागू होती है, जैसे कि नमूनों को शिपमेंट या बाद में विश्लेषण के लिए फ्रीज नहीं किया जा सकता है।
एपिजेनेटिक मार्कर हाल ही में फेनोटाइपिक विविधताओं के अध्ययन के लिए शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में उभरे हैं। इसके बाद, मानव ल्यूकोसाइट आबादी को सेल-वंश डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न दिखाया गया है जो डब्ल्यूबीसी सबसेट के सटीक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। एपिजेनेटिक मार्कर पर आधारित सबटाइटिंग एक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है जो ताजा रक्त नमूना संग्रह या महंगे एंटीबॉडी पर निर्भर नहीं करता है और रोग की शुरुआत और संवेदनशीलता के लिए बायोमार्कर के रूप में शोषण किया जा सकता है1,2,,3, 4,,5.5
ल्यूकोसिटे उपप्रकारों के लिए विशिष्ट उम्मीदवार एपिजेनेटिक मार्कर की पहचान करने के लिए ल्यूकोसिट उपप्रकारों में जीनोम (सीपीजी द्वीप) में मिथाइलेटेड विशिष्ट सीजी-समृद्ध क्षेत्रों के व्यापक मानचित्रण के लिए जीनोम-व्यापी अध्ययन किए गए हैं। पीसीआर प्रोटोकॉल मेथिलेटेड जीन क्षेत्रों के लिए इस कारण के कारण विकसित किया गया है, उदाहरण के लिए, CD3Z और FOXP3, CD3+ टी-सेल और CD4+ CD25+ नियामक टी-सेल (टी-रेग्स) के अनुरूप, क्रमशः । Wiencke एट अल टी कोशिकाओं के एपीजेनेटिक घटाव के लिए डुप्लेक्स बूंद पीसीआर की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है, परिणाम है कि अत्यधिक प्रवाह सक्रिय सेल छंटाई (FACS) विश्लेषण6के साथ सहसंबंधित उपज । यह मात्रात्मक आनुवंशिक विश्लेषण विधि टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड अणुओं और पीसीआर रिएजेंट्स को हजारों असतत, मात्रात्मक रूप से परिभाषित, शून्य, एक या एक से अधिक लक्षित न्यूक्लिक एसिड प्रतियों वाली बूंदों में विभाजित करने पर निर्भर करती है, जो माइक्रोफ्लुइडिक्स7,,8द्वारा सक्षम पानी-इन-ऑयल पायस का उपयोग करके। पीसीआर प्रवर्धन प्रत्येक व्यक्ति की बूंद के भीतर किया जाता है और प्रत्येक बूंद की अंतिम बिंदु फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापा जाता है, जिससे नमूने में मौजूद लक्ष्यों की पूर्ण मात्राकरण की अनुमति मिलती है। ड्रॉपलेट पीसीआर को मानक क्यूपीसीआर की तुलना में अधिक सटीक, सटीक और तकनीकी रूप से सरल होने के लिए स्थापित किया गया है, जिससे टी-कोशिकाओं के नैदानिक मूल्यांकन के लिए यह अधिक अनुकूल डीएनए मिथाइलेशन-आधारित विधि बन गई है। हालांकि तेजी से उभरती हुई सबटाइपिंग पद्धति, विभिन्न मिथाइलेटेड सीपीजी क्षेत्रों की जांच के लिए मल्टीप्लेक्स एपिजेनेटिक विश्लेषण की कमी है। यह नियमित ल्यूकोसाइट अंतर गिनती के लिए आवश्यक है।
इसके साथ ही, एक थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (टीपीई) ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को मिथाइलेशन-विशिष्ट मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर (एमडीपीसीआर) के लिए प्रस्तुत और नियोजित किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग सेल-वंश डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न यानी CD3Z और FOXP3 CpG क्षेत्रों के एपीजेनेटिक वेरिएशन के आधार पर क्रमशः विशिष्ट ल्यूकोसाइट उपप्रकार, सीडी 3+ टी-सेल और सीडी 4+ सीडी25+ टी-रेग्स को चित्रित करने के लिए किया गया है । डीएनए निष्कर्षण, बिसल्फी रूपांतरण और एमडीपीसीआर के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल टीपीई बूंद पीढ़ी डिवाइस के लिए एक निर्माण विधि के साथ संगीत कार्यक्रम में वर्णित है। विधि के प्रतिनिधि परिणामों की तुलना प्रस्तावित दृष्टिकोण की उपयोगिता को रेखांकित करते हुए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने वालों से की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रायोगिक प्रोटोकॉल और तरीके एक गढ़े हुए टीपीई ड्रॉपलेट जनरेटर, थर्मल साइकिलर और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इन-हाउस एमडीपीसीआर के लिए अनुमति देते हैं। नरम टीपीई से टीपीई बॉन्डि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कनाडा की राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
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