Metylering Specifik Multiplex Droplet PCR med hjälp av Polymer Droplet Generator Device för hematologiska diagnostik
Summary
Epigenetiska markörer används för undertypning av vita blodkroppar (WBC) genom kvantifiering av DNA-metyleringsmönster. Detta protokoll presenterar en multiplex droplet polymeras kedjereaktion (mdPCR) metod med hjälp av en termoplastisk elastomer (TPE)-baserade microfluidic enhet för droplet generation möjliggör exakt och multiplex metylering-specifika mål kvantifiering av WBC differential räknas.
Abstract
En multiplexed droplet PCR (mdPCR) arbetsflöde och detaljerade protokoll för att fastställa epigenetiska-baserade vita blodkroppar (WBC) differentialantal beskrivs, tillsammans med en termoplastisk elastomer (TPE) mikrofluidic droplet generation enhet. Epigenetiska markörer används för WBC subtyping som är av viktigt prognostiskt värde vid olika sjukdomar. Detta uppnås genom kvantifiering av DNA-metyleringsmönster av specifika CG-rika regioner i arvsmassan (CpG loci). I detta papper är bisulfitbehandlat DNA från mononukleära celler i perifert blod (PBMCs) inkapslat i droppar med mdPCR-reagenser inklusive primrar och hydrolyslysrörssonder som är specifika för CpG loci som korrelerar med WBC-subpopulationer. Multiplex tillvägagångssätt möjliggör förhör av många CpG lokus utan behov av separata mdPCR reaktioner, möjliggör mer exakt parametrisk bestämning av WBC sub-populationer med hjälp av epigenetiska analys av metylering platser. Denna exakta kvantifiering kan utvidgas till olika tillämpningar och belyser fördelarna för klinisk diagnos och efterföljande prognos.
Introduction
Analys av vita blodkroppar (WBCs) sammansättning är bland de mest efterfrågade laboratorietester i blodsjukdomar diagnostik. Differential leukocyte räkna fungerar som en indikator för ett spektrum av sjukdomar inklusive infektion, inflammation, anemi, och leukemi, och är under utredning som en tidig prognostisk biomarkör för flera andra villkor samt. Guldmyntfot i WBC subtyping innebär immunfärgning och/eller flödescytometri som båda kräver kostsamma, instabilitetsbenägna fluorescerande antikroppar och är ofta mycket beroende av operatörens kompetens vid provberedning. Denna metod är dessutom tillämplig på enbart färska blodprover, så att proverna inte kan frysas för transport eller senare analys.
Epigenetiska markörer har nyligen framträtt som kraftfulla analytiska verktyg för studier av fenotypiska variationer. Därefter har mänskliga leukocyte populationer visat sig ha cell-härstamning DNA metylering mönster som möjliggör den exakta karakterisering av WBC delmängder. Subtypning baserad på epigenetiska markörer ger ett lovande alternativ som inte är beroende av färsk blodprovsinsamling eller dyra antikroppar och kan utnyttjas som en biomarkör för sjukdomsanseringoch mottaglighet 1,2,3,4,5.
Genom-hela studier har utförts för omfattande kartläggning av metylerade specifika CG-rika regioner i arvsmassan (CpG öar) i leukocyte subtyper att identifiera kandidat epigenetiska markörer specifika för leukocyt subtyper. PCR-protokoll har utvecklats på grund av denna orsak till metylerade genregioner, t.ex.+ + + Wiencke et al. har visat nyttan av duplexdropp PCR för epigenetisk subtypning av T-Cells, vilket ger resultat som starkt korrelerar med FLÖDESAKTIVERAD CELLSORTERING (FACS) analys6. Denna kvantitativa genetiska analysmetod bygger på partitionering av mallen nukleinsyra molekyler och PCR reagenser i tusentals diskreta, volymetriskt definierade, sub-nanoliter stora droppar som innehåller noll, en eller flera mål nukleinsyra kopior, med hjälp av vatten-i-olja emulsioner aktiveras av mikrofluidik7,8. PCR-förstärkningen utförs inom varje enskild droppe och ändpunktens fluorescensintensitet för varje droppe mäts, vilket möjliggör absolut kvantifiering av mål som finns i provet. Droplet PCR har fastställts för att vara mer exakt, exakt, och tekniskt enklare än standard qPCR, vilket gör det till en mer gynnsam DNA-metyleringsbaserad metod för klinisk utvärdering av T-Cells. Även om en snabbt framväxande subtyping metod, multiplexed epigenetiska analys att sond för olika metylerade CpG regioner samtidigt saknas. Detta är nödvändigt för rutinmässiga leukocyte differential räknas.
Häri presenteras och anställd för metyleringsspecifik multiplexdroppe PCR (mdPCR) en termoplastisk elastomer (TPE) (TPE). Tekniken har använts för att avgränsa specifika leukocyte subtyper, CD3+ T-Cells och CD4+ CD25+ T-Regs, baserat på cell-härstamning DNA metylering mönster, dvs, epigenetisk variation av CD3Z och FOXP3 CpG regioner, respektive. Ett detaljerat protokoll för DNA-extraktion, bisulfitkonvertering och mdPCR beskrivs i samförstånd med en fabriceringsmetod för en TPE-dropletgenereringsapparat. Representativa resultat av metoden jämförs med de av immunofluorescens färgning belysa nyttan av den föreslagna metoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterade experimentella protokoll och metoder möjliggör in-house mdPCR med hjälp av en fabricerad TPE droplet generator, en termisk cycler och fluorescens mikroskop. Den tillverkade enheten med hjälp av mjuk TPE till TPE bindning ger hydrofoba ytegenskaper som är enhetliga över alla kanalväggar, så att den slutliga enheten inte kräver någon ytbehandling för efterföljande användning som en droppgenerator. Detta material har rutinmässigt anställda i point-of-care plattformar som kräver kompatibilite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från National Research Council of Canada.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. . The Autoimmune Diseases. , (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
