विभिन्न गोजातीय मस्तिष्क संरचनाओं में रेबीज वायरस का मात्रा
Summary
यह प्रोटोकॉल इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग करके विभिन्न गोजातीय मस्तिष्क शारीरिक संरचनाओं के भीतर रेबीज वायरस न्यूक्लियोप्रोटीन (एन) जीन कॉपी नंबर का निर्धारण करने के लिए एक क्यूआरटी-पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है।
Abstract
गोजातीय लकवा ग्रस्त रेबीज (बीपीआर) वायरल इंसेफेलाइटिस का एक रूप है जो पूरे लैटिन अमेरिका में पर्याप्त आर्थिक महत्व का है, जहां यह एक प्रमुख ज़ूनोटिक जोखिम बन गया है। यहां, हमारा उद्देश्य मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके विभिन्न गोजातीय मस्तिष्क शारीरिक संरचनाओं में रेबीज वायरस (आरएबीवी) जीनोम की सापेक्ष प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए एक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल का उपयोग करना था। क्यूआरटी-पीसीआर प्रवर्धन के बाद उत्सर्जित फ्लोरेसेंस के आधार पर नमूने में मौजूद जीन प्रतियों की विशिष्ट संख्या की मात्रा निर्धारित करती है जो नमूने में मौजूद लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की मात्रा के सीधे आनुपातिक होती है। यह विधि अपनी छोटी अवधि, संदूषण के कम जोखिम और अन्य तकनीकों की तुलना में अधिक आसानी से विभिन्न नमूनों में वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की क्षमता के कारण लाभप्रद है। छह पागल जानवरों के दिमाग को छह शारीरिक संरचनाओं में विभाजित किया गया था, नामत अमोन का सींग, सेरिबैलम, कॉर्टेक्स, मेडुला, पोन और थैलेसीमिया। सभी दिमाग एक प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षण के आधार पर RABV एंटीजन के लिए सकारात्मक के रूप में पहचाने गए थे । चार राबवि-नकारात्मक बोवाइन के दिमाग से एक ही शारीरिक संरचनाओं का भी आकलन किया गया । आरएनए को प्रत्येक ढांचे से निकाला गया था और क्यूआरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किया जाता था। इन विट्रो लिखित न्यूक्लियोप्रोटीन जीन का उपयोग करके राबवी जीन की कॉपी संख्या निर्धारित करने के लिए एक परख का प्रदर्शन किया गया था। वायरल आरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक वक्र ने 100% की दक्षता और 0.99 की रैखिकता का प्रदर्शन किया। विश्लेषण से पता चला है कि कॉर्टेक्स, मेडुला और थैलेसीमिया राबे का पता लगाने में उपयोग के लिए आदर्श सीएनएस भाग थे, जो इस अवलोकन के आधार पर थे कि इन संरचनाओं में राबवी के उच्चतम स्तर थे। परीक्षण विशिष्टता 100% थी। सभी नमूने सकारात्मक थे, कोई झूठी सकारात्मक पता नहीं चला । इस विधि का उपयोग उन नमूनों में आरएबीवी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जिनमें बीपीआर के निदान के दौरान राबवी का निम्न स्तर होता है।
Introduction
रेबीज की पुष्टि विभिन्न तकनीकों द्वारा पूर्व-पोस्टमार्टम और पोस्टमार्टम किया जा सकता है जो मस्तिष्क, त्वचा, मूत्र या लार1में वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम होते हैं। रेबीज वायरस न्यूक्लियोप्रोटीन(एन)जीन का पता लगाना मुख्य रूप से आणविक परीक्षणों द्वारा रेबीज निदान के लिए प्रयोग किया जाता है। इस जीन का इस्तेमाल वायरल जेनोटाइपिंग के लिए भी किया जाता है। रेबीज प्रभावित मस्तिष्क के किसी भी हिस्से का उपयोग कर जानवरों में निदान किया जा सकता है; हालांकि, रेबीज की संभावना को बाहर करने के लिए, मस्तिष्क में कम से कम दो क्षेत्रों से ऊतक2परीक्षण किया जाना चाहिए . जानवरों में रेबीज का पता लगाने के लिए कई नैदानिक तरीके मौजूद हैं; हालांकि, डायरेक्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंस टेस्ट स्टैंडर्ड रेफरेंस तकनीक3रहता है . अन्य परीक्षणों में जैविक परीक्षण शामिल हैं जो माउस टीका, ऊतक संस्कृति में संक्रमण, और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) 4 को शामिलकरतेहैं। इन सभी तकनीकों की सिफारिश विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) और विश्व पशु स्वास्थ्य संगठन (OIE) द्वारा मनुष्यों और जानवरों में रेबीज के निदान के लिए क्रमशः5।
न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने और प्रवर्धन तकनीकों ने हाल के वर्षों में रेबीज के निदान में क्रांतिकारी बदलाव किया हैऔर ये तकनीकें मानव रेबीज के पूर्व पोस्टमार्टम निदान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं । कई पीसीआर आधारित परीक्षणों का मूल्यांकन पूर्व-पोस्टमार्टम और पोस्टमार्टम रेबीज निदान 7,8,9,10के लिए पारंपरिक परीक्षणों के पूरक के लिए किया गया है । अधिकांश परखें रेबीज वायरल न्यूक्लियोप्रोटीन जीन को प्रवर्धन के लिए लक्षित करती हैं जो वायरल जीनोम 1,11में सबसे अधिकसंरक्षितक्षेत्र है । पिछले 20 वर्षों में, आरएबीवी का निदान करने के लिए विभिन्न आणविक परख विकसित की गई है, और इनमें से कुछ परख का उपयोग वायरस लक्षण वर्णन के लिए किया गया है। अधिकांश परीक्षणों का उद्देश्य वायरल जीनोम के भीतर संरक्षित जीन का पता लगाना है, जो आमतौर पर पारंपरिक या मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके12,13कहता है।
पीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील नैदानिक तकनीक है जो ऊतकों के भीतर किसी दिए गए रोगजनक के जीनोम का पता लगा सकती है, तब भी जब ये ऊतक विघटित होते हैं। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके, डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम14के चयनात्मक और दोहराव वाले प्रवर्धन के माध्यम से नैदानिक नमूने में संक्रामक एजेंट की न्यूनतम मात्रा का पता लगाया जा सकता है। क्यूआरटी-पीसीआर जिसमें फ्लोरोसेंट जांच (जैसे, TaqMan) या डीएनए बाध्यकारी रंगों (जैसे, SYBR ग्रीन) को शामिल किया गया है, का उपयोग परीक्षणों में किया गया है ताकि उच्च संवेदनशीलता के साथ आरएबीवी दोनों कानिदान किया जा सके और उच्चसंवेदनशीलता के साथ पोस्टमार्टम किया जा सके; हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। इस सीमा को दूर करने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) का सुझाव दिया गया है, जो आरएबीवी का पता लगाने के लिए इसकी कम लागत, सादगी और वांछनीय विशेषताओं के आधार पर है। यह परख विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि इसका उपयोग विकासशीलदेशोंमें किया जा सकता है ।
क्यूआरटी-पीसीआर एक अणु का पता लगाने और परिमाणीकरण पर आधारित है, जहां फ्लोरोसेंट सिग्नल बढ़ जाता है, एक ही प्रतिक्रिया में पीसीआर उत्पाद की मात्रा के प्रत्यक्ष अनुपात में होता है। जैसे-जैसे न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य की प्रतियों की संख्या बढ़ जाती है, इसलिए फ्लोरेसेंस बढ़ता है। गैर-विशिष्ट इंटरकैलिटिंग रंग जैसे SYBR ग्रीन डीएनए-बाध्यकारी डाई या अनुक्रम-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच एक फ्लोरोफोर और एक क्वेंचर ले जाने के लिए आमतौर पर क्यूआरटी-पीसीआर में फ्लोरोसेंट रीडआउट प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह परख पारंपरिक आरटी-पीसीआर पर लाभ प्रदान करती है जिसमें एक छोटा परीक्षण समय (2-4 एच), बंद ट्यूब सिस्टम (प्रवर्धित उत्पादों के पोस्ट-पीसीआर हेरफेर की कमी) के कारण संदूषण का कम जोखिम और एक साथ विभिन्न लक्ष्यों का पता लगाने की क्षमता16शामिल है। क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग लार और अन्य नमूनों से रेबीज पूर्व-पोस्टमार्टम का निदान करने के लिए किया जा सकता है। इस परख का उपयोग विभिन्न Lyssavirus प्रजातियों या आरएबीवी15की वंशावली का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक वास्तविक समय परीक्षण के रूप में भी किया जा सकता है। इस कॉम्बो आरटी-पीसीआर अप्रोच में दो रिएक्शन का इस्तेमाल किया जाता है। पहला राबाव के विभिन्न आनुवंशिक लिंगों का पता लगाता है, और दूसरा लाइसावायरस प्रजातियों का पता लगाता है। दोनों चरणों में क्यूआरटी-पीसीआर परख शामिल है, जहां पहला संकरण जांच का उपयोग करता है और दूसरा15रंगों का उपयोग करता है। इस तकनीक का उपयोग करके आरएबीवी के सफल आणविक पहचान का प्रदर्शन करने वाले परीक्षणों की बड़ी संख्या के कारण, वर्तमान ओआईई स्थलीय मैनुअल (2018) आरएबीवी17के आणविक पता लगाने के लिए पीसीआर के उपयोग की सिफारिश करता है।
मेक्सिको काफी पशुधन क्षमता के साथ एक देश है । सबसे अधिक पशुधन उत्पादन वाले राज्यों में आर्द्र उष्णकटिबंधीय क्षेत्र और शुष्क क्षेत्र दोनों होते हैं जो रेबीज के मुख्य ट्रांसमीटर पिशाच बैट डेस्मोडस रोटुंडस की उपस्थिति के कारण रेबीज फैलने के लिए खतरे में हैं । इसलिए, मक्सीको में गोजातीय लकवा रीज (बीपीआर) की रोकथाम और नियंत्रण के लिए अधिक उपकरण विकसित करना आवश्यक है। इसके आधार पर इस अध्ययन का उद्देश्य रेबीज संक्रमण के कारण होने वाली मौत के बाद गोजातीय दिमाग की विभिन्न शारीरिक संरचनाओं में वायरल कणों की संख्या निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करना था ।
नीचे वर्णित क्यूआरटी-पीसीआर प्रोटोकॉल के विकास में उपयोग के लिए एक बाहरी प्रयोगशाला द्वारा राब-पॉजिटिव बोवाइन से प्राप्त छह दिमाग दान किए गए थे। गोजातीय मस्तिष्क संरचना के नमूनों को कोल्ड-चेन इनीफाप सेनिड-एमए प्रयोगशाला बीएसएल-2 सुविधा में ले जाया गया और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। कैम्पेचे, युकाटन और क्वेरातारो राज्यों से जानवरों से दिमाग प्राप्त किया गया था। रसीद से पहले, दिमाग से विभिन्न संरचनाओं को विच्छेदित किया गया था। इन संरचनाओं में अमोन का सींग, सेरिबैलम, कॉर्टेक्स, मेडुला, पोन्स और थैलेसीमिया18,19शामिल थे। आनुवंशिक सामग्री के रूप में नीचे वर्णित निकाला गया था । आरएबीवी निदान की पुष्टि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए)20का उपयोग करके की गई थी । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, माउस दिमाग है कि RABV21 के साथ टीका लगाया गया था इस्तेमाल किया गया । इसके अतिरिक्त, चार RABV-नकारात्मक पशु दिमाग (डीएफए द्वारा निर्धारित के रूप में) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डीएफए केवल नमूना कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस)14पर संग्रहीत होने के सात दिनों के भीतर आरएबीवी का पता लगा सकता है । इसके विपरीत, इस काम से पता चला कि 12 दिनों के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय कृषि, वानिकी संस्थान और पशुधन अनुसंधान संस्थान (INIFAP) द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस दस्तावेज़ से जुड़े वीडियो के विकास में उनके सहयोग के लिए जेरज़ाइन फ्रास्ट्रो एस्क्विवेल को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
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