Количественная оценка вируса бешенства в различных структурах мозга крупного рогатого скота

Summary

Этот протокол представляет собой qRT-PCR-основанный подход для определения нуклеопротеина вируса бешенства (N) номер копии гена в различных анатомических структур мозга крупного рогатого скота с использованием транскрипции в пробирке.

Abstract

Паралитическое бешенство крупного рогатого скота (БНР) является одной из форм вирусного энцефалита, который имеет существенное экономическое значение во всей Латинской Америке, где он представляет собой крупный зоонозный риск. Здесь нашей целью было использовать лабораторный протокол для определения относительного количества копий генома вируса бешенства (RABV) в различных анатомических структурах мозга крупного рогатого скота с использованием количественных обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR). qRT-PCR количественно определяет определенное количество копий генов, присутствующих в образце на основе флуоресценции, испускаемой после усиления, что прямо пропорционально количеству целевой нуклеиновой кислоты, присутствуют в образце. Этот метод выгоден из-за его короткой продолжительности, снижение риска загрязнения, и потенциал для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот в различных образцах легче по сравнению с другими методами. Мозг шести бешеных животных был разделен на шесть анатомических структур, а именно рог Аммона, мозжечок, кору, медуллу, понс и таламус. Все мозги были определены как положительные для антигенов RABV на основе прямого теста иммунофлюоресценции. Были также оценены те же анатомические структуры из мозга четырех RABV-отрицательных бычьих коров. РНК извлекается из каждой структуры и используется для qRT-PCR. Был проведен анализ для определения копий генов RABV с использованием транскрибированного в пробирке нуклеопротеина гена. Стандартная кривая, используемая для количественной оценки вирусной РНК, продемонстрировали эффективность 100% и линейность 0,99. Анализ показал, что кора, медулла и таламус были идеальными частями ЦНС для использования в обнаружении RABV, основываясь на наблюдении, что эти структуры обладают самыми высокими уровнями RABV. Специфика теста составила 100%. Все пробы были положительными, ложных срабатываний обнаружено не было. Этот метод может быть использован для обнаружения RABV в образцах, которые содержат низкие уровни RABV во время диагностики BPR.

Introduction

Бешенство может быть подтверждено до смерти и вскрытия с помощью различных методов, которые позволяют обнаружения вирусных нуклеиновых кислот в головном мозге, коже, моче или^{слюне 1}. Обнаружение нуклеопротеина вируса бешенства(N)ген в основном используется для диагностики бешенства молекулярными тестами. Этот ген также используется для вирусного генотипирования. Бешенство может быть диагностировано у животных, использующих любую часть пораженного мозга; однако, чтобы исключить возможность бешенства, ткани, по крайней мере из двух областей в головном мозге должны быть проверены². Существует несколько диагностических методов выявления бешенства у животных; однако, прямой тест иммунофлуоресценции остается стандартной эталонной^{техникой 3.} Другие тесты включают биологические тесты, которые включают прививку мыши, инфекции в культуре тканей, и полимеразной цепной реакции (ПЦР)^4. Все эти методы рекомендованы Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (OIE) для диагностики бешенства у людей и животных,^{соответственно 5}.

Методы обнаружения и усиления нуклеиновой кислоты произвели революцию в^{диагностике бешенства в последние 6 лет, и эти} методы играют важную роль в диагностике бешенства человека. Несколько ПЦР-тесты были оценены в дополнение к обычным тестам для антемы и посмертного ^{бешенства диагнозы 7,8,9,10}. Большинство анализов целевой бешенства вирусный ген нуклеопротеина для усиления, который является наиболее высоко сохраниваемой области в вирусном^{геноме 1,11}. За последние 20 лет были разработаны различные молекулярные анализы для диагностики RABV, и некоторые из этих анализов были использованы для характеристики вируса. Большинство испытаний были направлены на обнаружение сохраненных генов в вирусном геноме, чаще всего с помощью обычных или количественных в режиме реального времени полимеразы цепной реакции (qRT-PCR)^{анализы 12,13}.

ПЦР является высокочувствительным диагностическим методом, который может обнаружить геном данного патогена в тканях, даже если эти ткани разлагаются. Используя ПЦР-подходы, минимальное количество инфекционного агента может быть обнаружено в клиническом образце путем селективного и повторяющегося усиления нуклеотидной последовательности^{ДНК 14.} qRT-PCR, который включает флуоресцентные зонды (например, TaqMan) или ДНК связывающие красители (например, SYBR Green) был использован в испытаниях для диагностики RABV как анте– и после– mortem с высокой чувствительностью; однако такой подход требует специального оборудования. Для преодоления этого ограничения было предложено использовать обратное транскрипционные циклы при посредничестве изотермального усиления (RT-LAMP) на основе его низкой стоимости, простоты и желательных характеристик для обнаружения RABV. Этот анализ особенно важен, поскольку он может быть использован в развивающихся странах¹⁵.

qRT-PCR основан на обнаружении и количественной оценке молекулы, где увеличение флуоресцентного сигнала напрямую пропорционально количеству продукта ПЦР в одной реакции. По мере увеличения количества копий цели нуклеиновой кислоты увеличивается и флуоресценция. Неспецифические интеркалирующие красители, такие как SYBR Green DNA-binding dye или последовательность конкретных олигонуклеотидных зондов, несущих флюорофор и утоливание, обычно используются для обеспечения флуоресцентного считывания в qRT-PCR. Этот анализ предлагает преимущества по сравнению с обычными RT-PCR, которые включают в себя более короткое время испытаний (2-4 ч), снижение риска загрязнения из-за закрытой трубки системы (отсутствие пост-PCR манипуляции усиленных продуктов), а также возможность обнаружения различных^{целей одновременно 16}. qRT-PCR может быть использован для диагностики бешенства до смерти от слюны и других образцов. Этот анализ также может быть использован в качестве универсального теста в режиме реального времени для обнаружения различных видов лиссавирусов или линий RABV¹⁵. В этом комбо RT-PCR подход, две реакции используются. Первый обнаруживает различные генетические линажи RABV, а второй обнаруживает виды лиссавирусов. Оба шага включают анализы qRT-PCR, где первый использует гибридизационые зонды, а второй использует красители^15. Из-за большого количества тестов, которые продемонстрировали успешное молекулярное обнаружение RABV с помощью этой техники, текущее наземное руководство МЕА (2018) рекомендует использовать ПЦР для молекулярного обнаружения RABV¹⁷.

Мексика является страной со значительным потенциалом животноводства. Государства с самым высоким животноводством содержат как влажные тропические регионы, так и сухие регионы, которые находятся под угрозой вспышек бешенства из-за присутствия летучей мыши-вампира Desmodus rotundus, основного передатчика бешенства. Поэтому необходимо разработать больше инструментов для профилактики и борьбы с паралитической бешенством крупного рогатого скота (БНР) в Мехико. Основываясь на этом, целью данного исследования было использование количественных qRT-PCR для определения количества вирусных частиц в различных анатомических структурах мозга крупного рогатого скота после смерти от бешенства инфекции.

Шесть мозгов, полученных из RABV-положительных бычьих лоз, были пожертвованы внешней лабораторией для использования в разработке описанного ниже протокола qRT-PCR. Образцы структуры мозга крупного рогатого скота были холодной цепью, транспортируется в лабораторию INIFAP CENID-MA BSL-2 и хранится при -80 градусов по Цельсию до использования. Мозги были получены от животных из штатов Кампече, юкатан и Керетаро. До получения, различные структуры были вскрыты из мозга. Эти структуры включали рога Аммона, мозжечок, кору, медуллу, понс и^{таламус 18,19}. Генетический материал был извлечен, как описано ниже. Диагноз RABV был подтвержден с использованием прямых флуоресцентных антител (DFA)²⁰. В качестве положительного контроля были использованы мозги мышей, которые были привиты RABV^21. Кроме того, четыре RABV-отрицательных мозга крупного рогатого скота (как это определено DFA) были использованы в качестве отрицательного контроля.

Protocol

Это исследование было одобрено и проведено в строгом соответствии с рекомендациями по использованию животных, предоставленными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Национального комитета по защите животных (CENID-MA). 1. Образцы Испо?…

Representative Results

Результаты DFA показали 100%, 100%, 83,3%, 66% и 50% положительность RABV в коре головного мозга, таламусе, медулле, понах и рогах соответственно. Эти результаты подтвердили предыдущие результаты, и по крайней мере три структуры, расчлененные из каждого мозга, были положительными для RABV. Представител?…

Discussion

Предыдущие исследования показали, что DFA может обнаружить RABV только в течение семи дней после того, как образец хранится при комнатной температуре (21 градус по Цельсию)¹⁴. В отличие от этого, эта работа показала, что чувствительность RT-PCR начинает снижаться после того, как обр?…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.