Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen

Summary

Dieses Protokoll stellt einen qRT-PCR-basierten Ansatz zur Bestimmung der Virus-Nukleoprotein (N)-Genkopienummer innerhalb verschiedener anatomischer Rinderhirnstrukturen unter Verwendung von In-vitro-Transkription dar.

Abstract

Rinder-Paralytische Tollwut (BPR) ist eine Form der viralen Enzephalitis, die in ganz Lateinamerika von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung ist und ein großes Zoonoserisiko darstellt. Hier galt es, mithilfe eines Laborprotokolls die relative Kopiernummer des Tollwutvirus-Genoms (RABV) in verschiedenen anatomischen Rinderhirnstrukturen mithilfe quantitativer Realzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) zu bestimmen. qRT-PCR quantifiziert die spezifische Anzahl der Genkopien, die in einer Probe auf der Grundlage der nach der Amplifikation emittierten Fluoreszenz vorhanden sind und direkt proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen Zielnukleinsäure sind. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner kurzen Dauer, des reduzierten Kontaminationsrisikos und des Potenzials, virale Nukleinsäuren in verschiedenen Proben leichter als andere Techniken zu erkennen, von Vorteil. Die Gehirne von sechs tollwütigen Tieren wurden in sechs anatomische Strukturen unterteilt, nämlich das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus. Alle Gehirne wurden auf der Grundlage eines direkten Immunfluoreszenztests als positiv für RABV-Antigene identifiziert. Die gleichen anatomischen Strukturen aus den Gehirnen von vier RABV-negativen Rindern wurden ebenfalls bewertet. DIE RNA wurde aus jeder Struktur extrahiert und für qRT-PCR verwendet. Ein Test wurde durchgeführt, um die Kopiennummern von RABV-Genen unter Verwendung eines in vitro transkribierten Nukleoprotein-Gens zu bestimmen. Die Standardkurve zur Quantifizierung viraler RNA wies eine Effizienz von 100% und eine Linearität von 0,99 auf. Die Analyse ergab, dass der Kortex, die Medulla und der Thalamus die idealen ZNS-Portionen für den Einsatz bei der RABV-Erkennung waren, basierend auf der Beobachtung, dass diese Strukturen die höchsten RABV-Werte besaßen. Die Testspezifität betrug 100%. Alle Proben waren positiv, es wurden keine fehlpositiven Ergebnisse festgestellt. Diese Methode kann verwendet werden, um RABV in Proben zu erkennen, die während der Diagnose von BPR niedrige RABV-Spiegel enthalten.

Introduction

Tollwut kann ante-mortem und post-mortem durch verschiedene Techniken bestätigt werden, die den Nachweis von viralen Nukleinsäuren im Gehirn, Haut, Urin oder Speichel ermöglichen¹. Der Nachweis des Tollwutvirus-Nukleoprotein (N) Wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Dieses Gen wird auch für die virale Genotypisierung verwendet. Tollwut kann bei Tieren mit jedem Teil des betroffenen Gehirns diagnostiziert werden; Um jedoch die Möglichkeit von Tollwut auszuschließen, muss Gewebe aus mindestens zwei Regionen im Gehirn getestet werden². Es gibt mehrere diagnostische Methoden für den Tollwutnachweis bei Tieren; der direkte Immunfluoreszenztest bleibt jedoch die Standard-Referenztechnik³. Andere Tests umfassen biologische Tests, die Maus-Impfung, Infektion in der Gewebekultur und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)⁴. Alle diese Techniken werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) zur Diagnose von Tollwut bei Mensch und Tier^empfohlen.

Nukleinsäurenachweis- und -amplifikationstechniken haben die Tollwutdiagnose in den letzten Jahren revolutioniert⁶ und diese Techniken spielen eine wichtige Rolle bei der Ante-mortem-Diagnose menschlicher Tollwut. Mehrere PCR-basierte Tests wurden als Ergänzung zu herkömmlichen Tests für Anti-Mortem- und Post-Mortem-Tollwut-Diagnosen ^7,8,9,10ausgewertet. Die meisten Assays zielen auf das virale Nukleoproteingen tollwutium, das die am höchsten konservierte Region im viralen Genom^1,11ist. In den letzten 20 Jahren wurden verschiedene molekulare Assays entwickelt, um RABV zu diagnostizieren, und einige dieser Assays wurden für die Viruscharakterisierung verwendet. Die meisten Studien zielten darauf ab, konservierte Gene innerhalb des viralen Genoms zu detektieren, am häufigsten mithilfe konventioneller oder quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Assays^12,13.

PCR ist eine hochempfindliche diagnostische Technik, die das Genom eines bestimmten Krankheitserregers im Gewebe erkennen kann, auch wenn diese Gewebe zersetzt werden. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz¹⁴nachgewiesen werden. qRT-PCR, die fluoreszierende Sonden (z. B. TaqMan) oder DNA-Bindende Farbstoffe (z. B. SYBR Green) enthält, wurde in Studien zur Diagnose von RABV sowohl ante– als auch post– mortem mit hoher Empfindlichkeit verwendet; ein solcher Ansatz erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde reverse transkription-Loop-vermittelte isothermale Amplifikation (RT-LAMP) vorgeschlagen, basierend auf seinen niedrigen Kosten, Einfachheit und wünschenswerten Eigenschaften für die Erkennung von RABV. Dieser Test ist besonders wichtig, da er in Entwicklungsländern verwendet werden kann¹⁵.

qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen. Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Unspezifische interkalierende Farbstoffe wie der SYBR Green DNA-Bindender Farbstoff oder sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden mit einem Fluorophor und einem Quencher werden häufig verwendet, um die fluoreszierende Auslesung in qRT-PCR bereitzustellen. Dieser Test bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen RT-PCR, die eine kürzere Testzeit (2–4 h), ein geringeres Kontaminationsrisiko durch das geschlossene Rohrsystem (fehlende Post-PCR-Manipulation von verstärkten Produkten) und die Fähigkeit, verschiedene Ziele gleichzeitig zu^{erkennen, 16}umfassen. qRT-PCR kann verwendet werden, um Tollwut ante-mortem aus Speichel und anderen Proben zu diagnostizieren. Dieser Assay kann auch als universeller Echtzeittest für den Nachweis verschiedener Lyssavirus-Arten oder Abstammungen von RABV¹⁵verwendet werden. Bei diesem Combo RT-PCR-Ansatz werden zwei Reaktionen verwendet. Die erste detektiert verschiedene genetische Linages von RABV, die zweite die Lyssavirus-Arten. Beide Schritte beinhalten qRT-PCR-Assays, wobei der erste Hybridisierungssonden und der zweite Farbstoff¹⁵verwendet. Aufgrund der Vielzahl von Tests, die eine erfolgreiche molekulare Detektion von RABV mit dieser Technik nachgewiesen haben, empfiehlt das aktuelle OIE Terrestrial Manual (2018) den Einsatz von PCR für den molekularen Nachweis von RABV¹⁷.

Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind. Daher ist es wichtig, mehr Instrumente zur Verhütung und Bekämpfung von rinderparalytischer Tollwut (BPR) in Mexiko zu entwickeln. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel dieser Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod durch Tollwutinfektion zu bestimmen.

Sechs Gehirne, die von RABV-positiven Rindern gewonnen wurden, wurden von einem externen Labor für den Einsatz bei der Entwicklung des unten beschriebenen qRT-PCR-Protokolls gespendet. Die Rinderstrukturproben wurden kaltkett in die INIFAP CENID-MA Laboranlage BSL-2 transportiert und bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert. Die Gehirne wurden von Tieren aus den Bundesstaaten Campeche, Yucatén und Querétaro gewonnen. Vor der Quittung wurden verschiedene Strukturen aus dem Gehirn seziert. Zu diesen Strukturen gehörten das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus^18,19. Genetisches Material wurde wie unten beschrieben extrahiert. Die RABV-Diagnose wurde mit direkten fluoreszierenden Antikörpern (DFA)²⁰bestätigt. Als positiv zu steuernde, Mausgehirne, die mit RABV²¹ geimpft wurden, wurden verwendet. Zusätzlich wurden vier RABV-negative Rinderhirne (wie von DFA bestimmt) als Negativkontrollen verwendet.

Protocol

Diese Studie wurde von den Empfehlungen des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (IACUC) des Centro Nacional de Investigacion Disciplinaria en Microbiologa Animal (CENID-MA) genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Verwendung von Tieren durchgeführt. 1. Proben Verwenden Sie verschiedene Bereiche des Gehirns, die von 6 verschiedenen tollwut-positiven Rinderhirnen für die RT-PCR-Analyse seziert wurden. <p class="jove_t…

Representative Results

Die DFA-Ergebnisse zeigten 100%, 100%, 83,3%, 66% und 50% Positivität für RABV im Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn. Diese Ergebnisse bestätigten die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Eine repräsentative positive DAF-Färbung ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Verstärkung eines Fragments des RABV N-Gens (Schritt 5.5) mi…

Discussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass DFA RABV nur innerhalb von sieben Tagen nach der Lagerung der Probe bei Raumtemperatur (21 °C)¹⁴erkennen kann. Im Gegensatz dazu zeigte diese Arbeit, dass die Empfindlichkeit von RT-PCR abnimmt, nachdem die Proben 12 Tage lang der Raumtemperatur ausgesetzt waren. Daher kann das RABV-Genom mit qRT-PCR in Proben nachgewiesen werden, die bis zu 23 Tage raumtemperaturexponiert sind. Dies zeigt, dass die Empfindlichkeit von qRT-PCR bei stärker zersetzten Proben re…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.