كمية فيروس داء الكلب في مختلف هياكل الدماغ البقري

Summary

يقدم هذا البروتوكول نهجا قائما على qRT-PCR لتحديد رقم نسخة الجينات لفيروس داء الكلب (N) داخل مختلف الهياكل التشريحية للدماغ البقري باستخدام النسخ المختبري.

Abstract

داء الكلب الأبقار الشللي (BPR) هو شكل من أشكال التهاب الدماغ الفيروسي الذي له أهمية اقتصادية كبيرة في جميع أنحاء أمريكا اللاتينية، حيث يشكل خطرا حيوانيا كبيرا. هنا، كان هدفنا هو استخدام بروتوكول مختبري لتحديد عدد النسخ النسبية من جينوم فيروس داء الكلب (RABV) في الهياكل التشريحية المختلفة للدماغ البقري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). يحدد qRT-PCR عدد النسخ الجينية المحددة الموجودة في عينة استنادا إلى الفلورسينس المنبعث بعد التضخيم الذي يتناسب بشكل مباشر مع كمية الحمض النووي المستهدف الموجودة في العينة. هذه الطريقة مفيدة نظرا لقصر مدة، وانخفاض خطر التلوث، وإمكانية الكشف عن الأحماض النووية الفيروسية في عينات مختلفة بسهولة أكبر بالمقارنة مع التقنيات الأخرى. تم تقسيم أدمغة ستة مسعورة إلى ستة هياكل تشريحية ، وهي قرن الأمون والمخيخ والقشرة والمولدة والمهور والمهاد. تم تحديد جميع الأدمغة على أنها إيجابية لمضادات RABV استنادا إلى اختبار المناعة المباشر. كما تم تقييم نفس الهياكل التشريحية من أدمغة أربعة أبقار سلبية من RABV. تم استخراج الحمض النووي الريبي من كل هيكل واستخدامها لQRT-PCR. تم إجراء فحص لتحديد أرقام نسخ جينات RABV باستخدام جين نوكليوبروتين منقول في المختبر. أظهر المنحنى القياسي المستخدم لقياس الحمض النووي الريبي الفيروسي كفاءة 100٪ وخطية 0.99. وكشف التحليل أن القشرة، والذبولة، والمهاد هي الأجزاء المثالية من الجهاز العصبي المركزي لاستخدامها في الكشف عن رابعة التدخل السريع، استنادا إلى ملاحظة أن هذه الهياكل تمتلك أعلى مستويات RABV. كانت خصوصية الاختبار 100٪. وكانت جميع العينات إيجابية، ولم يتم الكشف عن أي إيجابيات كاذبة. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن RABV في العينات التي تحتوي على مستويات منخفضة من RABV أثناء تشخيص BPR.

Introduction

يمكن تأكيد داء الكلب قبل الوفاة وبعد الوفاة من خلال تقنيات مختلفة تمكن من الكشف عن الأحماض النووية الفيروسية في الدماغ أو الجلد أو البول أو اللعاب^1. الكشف عن فيروس داء الكلب نيوكليوبروتين(N)الجين يستخدم في المقام الأول لتشخيص داء الكلب عن طريق الاختبارات الجزيئية. ويستخدم هذا الجين أيضا لل genotyping الفيروسية. يمكن تشخيص داء الكلب في الحيوانات باستخدام أي جزء من الدماغ المصاب. ومع ذلك ، لاستبعاد احتمال داء الكلب ، يجب اختبار الأنسجة من منطقتين على الأقل في الدماغ². توجد عدة طرق تشخيصية للكشف عن داء الكلب في الحيوانات؛ ومع ذلك ، فإن اختبار المناعة المباشر يبقى التقنية المرجعية القياسية³. وتشمل الاختبارات الأخرى الاختبارات البيولوجية التي تتضمن تلقيح الفئران، والعدوى في زراعة الأنسجة، والبوليميراز سلسلة من ردود الفعل (PCR)⁴. وتوصي منظمة الصحة العالمية والمنظمة العالمية للصحة الحيوانية (OIE) جميع هذه التقنيات لتشخيص داء الكلب في البشر والحيوانات، على التوالي^5.

وقد أحدثت تقنيات الكشف عن الحمض النووي والتضخيم ثورة في تشخيص داء الكلب في السنوات الأخيرة⁶ وتلعب هذه التقنيات دورا هاما في تشخيص داء الكلب البشري قبل الوفاة. تم تقييم العديد من الاختبارات القائمة على PCR لاستكمال الاختبارات التقليدية لتشخيص داء الكلب قبل الوفاة وبعد الوفاة ^7و8و9و10. معظم المقايسات تستهدف داء الكلب الفيروسية نيوكليوبروتين الجينات للتضخيم الذي هو المنطقة الأكثر حفظا للغاية في الجينوم الفيروسي^1،11. في السنوات العشرين الماضية، تم تطوير مختلف المقايسات الجزيئية لتشخيص RABV، وقد استخدمت بعض هذه المقايسات لتحديد خصائص الفيروس. وقد استهدفت معظم التجارب للكشف عن الجينات المحفوظة داخل الجينوم الفيروسي، والأكثر شيوعا باستخدام التقليدية أو الكمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (qRT-PCR) المقايسات^12،13.

PCR هو تقنية تشخيص حساسة للغاية يمكنها اكتشاف جينوم مسببات الأمراض المعطى داخل الأنسجة ، حتى عندما تتحلل هذه الأنسجة. باستخدام النهج القائمة على PCR ، يمكن اكتشاف كميات ضئيلة من العامل المعدي في عينة سريرية من خلال التضخيم الانتقائي والمتكرر لتسلسل نيوكليوتيد الحمض النووي^14. وقد استخدم qRT-PCR الذي يتضمن مسابير فلورية (مثل TaqMan) أو الأصباغ الملزمة للحمض النووي (مثل SYBR Green) في التجارب لتشخيص RABV قبل– وبعد– الوفاة بحساسية عالية؛ غير أن هذا النهج يتطلب معدات متخصصة. وللتغلب على هذا القيد، اقترح التضخيم الحراري (RT-LAMP) بوساطة حلقة النسخ العكسي، استنادا إلى تكلفته المنخفضة وبساطته وخصائصه المستصوبة للكشف عن رابعة رابعة. هذا المقايسة مهمة بشكل خاص حيث يمكن استخدامها في البلدان^{النامية 15.}

ويستند qRT-PCR على الكشف عن وتكميم جزيء، حيث زيادات إشارة الفلورسنت هي في نسبة مباشرة إلى كمية المنتج PCR في رد فعل واحد. كما يزيد عدد نسخ من هدف الحمض النووي، وكذلك لا الفلورسينس. وتستخدم عادة الأصباغ المتشابكة غير محددة مثل صبغة الحمض النووي الأخضر SYBR ملزمة أو مسابير أوليغونوكليوتيد تسلسل محددة تحمل الفلوروفور وquencher لتوفير قراءات الفلورسنت في qRT-PCR. هذا المقايسة يوفر مزايا على RT-PCR التقليدية التي تشمل أقصر وقت الاختبار (2-4 ساعة), انخفاض خطر التلوث بسبب نظام أنبوب مغلق (عدم وجود تلاعب بعد PCR من المنتجات تضخيم), والقدرة على الكشف عن أهداف مختلفة في وقت واحد¹⁶. يمكن استخدام qRT-PCR لتشخيص داء الكلب قبل الوفاة من اللعاب وعينات أخرى. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا المقايسة كاختبار عالمي في الوقت الحقيقي للكشف عن أنواع مختلفة من فيروس ليسا أو الأنساب من RABV¹⁵. في هذا التحرير والسرد RT-PCR النهج، يتم استخدام اثنين من ردود الفعل. الأول يكشف عن النعور الوراثية المختلفة ل RABV، والثاني يكشف عن أنواع فيروس ليسا. تتضمن كلتا الخطوتين فحوصات qRT-PCR ، حيث تستخدم الأولى مسابير التهجين وتستخدم الثانية الأصباغ¹⁵. نظرا للعدد الكبير من الاختبارات التي أثبتت نجاح الكشف الجزيئي عن RABV باستخدام هذه التقنية ، يوصي الدليل الأرضي الحالي لمنظمة OIE (2018) باستخدام PCR للكشف الجزيئي عن RABV^17.

والمكسيك بلد لديه إمكانات كبيرة في الثروة الحيوانية. وتحتوي الولايات التي لديها أعلى إنتاج من الماشية على كل من المناطق المدارية الرطبة والمناطق الجافة المعرضة لخطر تفشي داء الكلب بسبب وجود خفاش مصاصي الدماء ديسمودوس روتوندوس، وهو المرسل الرئيسي لداء الكلب. لذلك، من الضروري تطوير المزيد من الأدوات للوقاية من داء الكلب الأبقار ومكافحة (BPR) في المكسيك. وبناء على ذلك، كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام qRT-PCR الكمي لتحديد عدد الجسيمات الفيروسية في الهياكل التشريحية المختلفة للأدمغة البقرية بعد الوفاة بسبب عدوى داء الكلب.

تبرع مختبر خارجي بستة أدمغة تم الحصول عليها من الأبقار الإيجابية ل RABV لاستخدامها في تطوير بروتوكول qRT-PCR الموضح أدناه. تم نقل عينات بنية الدماغ البقري إلى مختبر INIFAP CENID-MA BSL-2 وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم الحصول على الأدمغة من الحيوانات من ولايات كامبيتشي، يوكاتان، وكيريتارو. قبل الاستلام، تم تشريح هياكل مختلفة من العقول. وشملت هذه الهياكل القرن الأمون، المخيخ، القشرة، النخاع، المهور، والمهاد^18،19. تم استخراج المواد الوراثية كما هو موضح أدناه. تم تأكيد تشخيص RABV باستخدام الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA)²⁰. وكعنصر تحكم إيجابي، تم استخدام أدمغة الفئران التي تم تلقيحها ب RABV^21. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت أربعة أدمغة ماشية سلبية من RABV (كما يحددها DFA) كضوابط سلبية.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة وأجريت وفقا للتوصيات المتعلقة باستخدام الحيوانات التي قدمتها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة للجنة الوطنية ل Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA). 1. عينات استخدام مناطق مختلفة من الدماغ تشريح من 6 مختلف العقول البقري?…

Representative Results

وأظهرت نتائج DFA 100٪، 100٪، 83.3٪، 66٪، و 50٪ الإيجابية لرابف في القشرة والمهاد والميدالية والمهور والقرن، على التوالي. وأكدت هذه النتائج النتائج السابقة، وكانت ثلاثة على الأقل من الهياكل التي تم تشريحها من كل دماغ إيجابية ل RABV. يظهر ممثل إيجابي DAF تلطيخ في الشكل 1. <…

Discussion

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن DFA يمكن الكشف عن RABV فقط في غضون سبعة أيام من العينة التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية)¹⁴. وعلى النقيض من ذلك، أظهر هذا العمل أن حساسية RT-PCR تبدأ في الانخفاض بعد تعرض العينات لدرجة حرارة الغرفة لمدة 12 يوما. لذلك، يمكن الكشف عن جينوم RABV …

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.