各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

Summary

このプロトコルは、in vitro転写を用いて様々な牛脳解剖学的構造内の狂犬病ウイルスヌクレオプロテイン(N)遺伝子コピー数を決定するためのqRT-PCRベースのアプローチを提示する。

Abstract

牛麻痺狂犬病(BPR)は、大きな人獣共通感染症をもたらすラテンアメリカ全体で経済的に重要なウイルス性脳炎の一種です。ここで我々の目的は、実験プロトコルを用いて、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて、異なる牛脳解剖学的構造における狂犬病ウイルス(RABV)ゲノムの相対的なコピー数を決定することであった。qRT-PCR は、サンプル中に存在する標的核酸の量に直接比例する増幅後に放出される蛍光に基づいてサンプルに存在する特定の数の遺伝子コピーを定量化します。この方法は、その短い期間、汚染のリスクの低減、および他の技術と比較してより容易に異なるサンプル内のウイルス核酸を検出する可能性のために有利である。狂犬病の6匹の動物の脳は、アンモンの角、小脳、皮質、髄質、ポン、視床の6つの解剖学的構造に分けられた。すべての脳は、直接免疫蛍光試験に基づいてRABV抗原に陽性であると同定された。4つのRABV陰性ウシの脳から同じ解剖学的構造も評価された。RNAを各構造から抽出し、qRT-PCRに使用した。インビトロ転写されたヌクレオタンパク質遺伝子を用いてRABV遺伝子のコピー数を決定するためにアッセイを行った。ウイルスRNAを定量化するために使用される標準曲線は、100%の効率と0.99の直線性を示した。分析の結果、これらの構造がRABVの最高レベルを有するという観察に基づいて、皮質、髄質、視床がRABV検出に使用する理想的なCNS部分であることがわかりました。試験特異性は100%であった。すべてのサンプルは陽性であり、偽陽性は検出されなかった。BPRの診断中に、低レベルのRABVを含むサンプルでRABVを検出するために使用できます。

Introduction

狂犬病は、脳、皮膚、尿、または唾液中のウイルス核酸の検出を可能にする様々な技術によって、前死性および事後分析を確認することができる^1。狂犬病ウイルスの核タンパク質(N)遺伝子の検出は、主に分子検査による狂犬病診断に用いられる。この遺伝子は、ウイルスのジェノタイピングにも使用されます。狂犬病は、影響を受けた脳の任意の部分を使用して動物で診断することができます。しかし、狂犬病の可能性を排除するために、脳内の少なくとも2つの領域からの組織を2をテストする必要^{があります。}動物の狂犬病検出にはいくつかの診断方法が存在する。しかし、直接免疫蛍光試験は標準基準技術³のままである。その他の試験には、マウスの接種、組織培養における感染、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)4を組み込んだ生物学的試験が含^まれる。これらの技術はすべて、世界保健機関(WHO)と世界動物衛生機構(OIE)が、人間と動物の狂犬病の診断に推奨^{しています。}

核酸検出および増幅技術は、近年⁶年に狂犬病の診断に革命をもたらし、これらの技術はヒト狂犬病のアンティ・モーテム診断において重要な役割を果たしている。いくつかのPCRベースのテストは、アンティモテと死後の狂犬病の診断^{7、8、9、10}のための従来のテスト^を補完するために評価されています。ほとんどのアッセイは、ウイルスゲノム^1,11において最も保存性の高い領域である増幅のための狂犬病ウイルス核タンパク質遺伝子を標的とする。この20年の間にRABVを診断するために様々な分子アッセイが開発され、これらのアッセイの一部がウイルス特性評価に用いられてきた。ほとんどの試験は、ウイルスゲノム内の保存された遺伝子を検出することを目的としており、最も一般的には従来のまたは定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)アッセイ^12,13を用いて行^う。

PCRは、これらの組織が分解されても、組織内の特定の病原体のゲノムを検出することができる高感度診断技術です。PCRベースのアプローチを用いて、DNAヌクレオチド配列¹⁴の選択的かつ反復的な増幅を通して臨床サンプルで感染因子の最小量を検出することができる。蛍光プローブ(例えば、TaqMan)またはDNA結合色素(例えば、SYBRグリーン)を組み込んだqRT-PCRは、RABVを高感度で アンティと ポストの両方 の分析 の診断に試験で使用されています。ただし、このようなアプローチには特殊な機器が必要です。この制限を克服するために、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)は、その低コスト、シンプルさ、およびRABVの検出に望ましい特性に基づいて示唆されている。このアッセイは、発展途上国¹⁵で使用することができるので特に重要である。

qRT-PCR は分子の検出と定量に基づいており、蛍光シグナルの増加は、単一の反応で PCR 産物の量に直接比例します。核酸標的のコピー数が増加するにつれて、蛍光も増加する。蛍光色素およびクエンチャーを運ぶSYBRグリーンDNA結合色素や配列特異的オリゴヌクレオチドプローブなどの非特異的なインターカレート色素は、一般的にqRT-PCRで蛍光読み出しを提供するために使用されます。このアッセイは、試験時間の短縮(2~4時間)、閉管システムによる汚染リスクの低減(増幅産物のPCR後の操作の欠如)、および異なるターゲット^を同時に検出する機能を含む従来のRT-PCRよりも利点を提供します。qRT-PCRは唾液および他のサンプルからの狂犬病の前検を診断するために使用することができる。このアッセイはまた、RABV¹⁵の異なるリッサウイルス種または系統の検出のための普遍的なリアルタイムテストとして使用することができる。このコンボRT-PCRアプローチでは、2つの反応が使用されます。最初はRABVの異なる遺伝的なリナジを検出し、第二はリサウイルス種を検出する。どちらのステップもqRT-PCRアッセイを含み、最初はハイブリダイゼーションプローブを使用し、2番目は染料¹⁵を使用します。この技術を用いてRABVの分子検出に成功した多数の試験のために、現在のOIE地球マニュアル(2018)は、RABV¹⁷の分子検出のためのPCRの使用を推奨しています。

メキシコは家畜の可能性が高い国です。家畜生産量が最も高い州には、狂犬病の主な送信機である吸血鬼コウモリ デスモドゥス・ロタンドゥス の存在により狂犬病の流行の危険にさらされている湿気の多い熱帯地域と乾燥した地域の両方が含まれています。そのため、メキシコの牛麻痺性狂犬病(BPR)の予防と制御のためのより多くのツールを開発することが不可欠です。これに基づいて、本研究の目的は、狂犬病感染による死亡後の牛脳の異なる解剖学的構造におけるウイルス粒子の数を決定するために定量的なqRT-PCRを使用することであった。

RABV陽性ウシから得られた6つの脳を、以下に記載するqRT-PCRプロトコルの開発に使用するために外部の実験室から寄贈された。ウシの脳構造サンプルを、INIFAP CENID-MAラボBSL-2施設に冷鎖輸送し、使用するまで-80°Cで保存した。脳はカンペチェ、ユカタン、ケレタロの州から動物から得られた。領収書の前に、様々な構造が脳から解剖されました。これらの構造には、アンモンの角、小脳、皮質、髄質、ポン、視床^18、19が含まれていました。遺伝物質は以下に記載されるように抽出した。RABV診断は、直接蛍光抗体(DFA)20を用いて確認した。陽性対照として^、RABV21を接種したマウス脳が用いられた。さらに、4つのRABV陰性牛の脳(DFAによって決定される)を陰性対照として使用した。

Protocol

この研究は、中央ナシオナル・デ・インベスティガシオン・ディシプリカルティフィケーション・エン・微生物学動物(CENID-MA)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が提供する動物の使用に関する勧告に従って承認され、厳格に実施されました。 1. サンプル RT-PCR分析のために6つの異なる狂犬病陽性ウシ脳から解剖された脳の異なる領域を使用してください。 …

Representative Results

DFAの結果は、それぞれ100%、100%、83.3%、66%、および50%の皮質、視床、髄質、ポン、ホーンにおけるRABVの陽性を示した。これらの結果は、前の結果を確認し、各脳から解剖された構造の少なくとも3つはRABVに陽性であった。代表的な正の DAF 染色を 図 1に示します。 図2 は、Loza-Rubioららによって報告されたプライマーを最初に有?…

Discussion

これまでの研究では、DFAは、試料が室温(21°C)14で保存されてから7日以内にRABVを検出することしかできないということが示されている。これに対し、この研究は、サンプルが室温に12日間曝露された後、RT-PCRの感度が低下し始めるということを実証した。したがって、RABVゲノムは、室温に曝露されたサンプル中のqRT-PCRによって最大23日間検出することができる。これは、よ?…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.