Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

Summary

Questo protocollo presenta un approccio basato su qRT-PCR per determinare il numero di copia genica della nucleoproteina del virus della rabbia (N) all’interno di varie strutture anatomiche cerebrali bovine utilizzando la trascrizione in vitro.

Abstract

La rabbia paralitica bovina (BPR) è una forma di encefalite virale di notevole importanza economica in tutta l’America Latina, dove presenta un grave rischio zoonotico. Qui, il nostro obiettivo era quello di utilizzare un protocollo di laboratorio per determinare il numero relativo di copie del genoma del virus della rabbia (RABV) in diverse strutture anatomiche del cervello bovino utilizzando la reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica il numero specifico di copie geniche presenti in un campione basato sulla fluorescenza emessa dopo l’amplificazione che è direttamente proporzionale alla quantità di acido nucleico bersaglio presente nel campione. Questo metodo è vantaggioso per la sua breve durata, il ridotto rischio di contaminazione e il potenziale di rilevare gli acidi nucleici virali in campioni diversi più facilmente rispetto ad altre tecniche. Il cervello di sei animali rabbiosi era diviso in sei strutture anatomiche, vale a dire il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, il pons e il talamo. Tutti i cervelli sono stati identificati come positivi per gli antigeni RABV sulla base di un test di immunofluorescenza diretta. Sono state valutate anche le stesse strutture anatomiche provenienti dal cervello di quattro bovini rabv-negativi. L’RNA è stato estratto da ogni struttura e utilizzato per qRT-PCR. È stato eseguito un test per determinare il numero di copie dei geni RABV utilizzando un gene nucleoproteina trascritto in vitro. La curva standard utilizzata per quantificare l’RNA virale presentava un’efficienza del 100% e una linearità dello 0,99. L’analisi ha rivelato che la corteccia, il midollo e il talamo erano le porzioni ideali del SNC da utilizzare nel rilevamento RABV, in base all’osservazione che queste strutture possedevano i più alti livelli di RABV. La specificità del test era del 100%. Tutti i campioni erano positivi, non sono stati rilevati falsi positivi. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare rabv in campioni che contengono bassi livelli di RABV durante la diagnosi di BPR.

Introduction

La rabbia può essere confermata ante mortem e post mortem con varie tecniche che consentono il rilevamento di acidi nucleici virali nel cervello, nella pelle, nelle urine o nella saliva¹. L’individuazione del gene della nucleoproteina del virus della rabbia(N)viene utilizzata principalmente per la diagnosi della rabbia mediante test molecolari. Questo gene è anche usato per il genotipizzazione virale. La rabbia può essere diagnosticata negli animali utilizzando qualsiasi porzione del cervello interessato; tuttavia, per escludere la possibilità di rabbia, i tessuti provenienti da almeno due regioni del cervello devono essere testati². Esistono diversi metodi diagnostici per l’individuazione della rabbia negli animali; tuttavia, il test di immunofluorescenza diretta rimane la tecnica di riferimento standard³. Altri test includono test biologici che incorporano l’inoculazione del topo, l’infezione nella coltura tissutale e la reazione a catena della polimerasi (PCR)⁴. Tutte queste tecniche sono raccomandate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) e dall’Organizzazione Mondiale della Sanità Animale (OIE) per la diagnosi di rabbia nell’uomo e negli animali,^{rispettivamente 5}.

Le tecniche di rilevazione e amplificazione degli acidi nucleici hanno rivoluzionato la diagnosi di rabbia negli^{ultimi anni 6 e} queste tecniche svolgono un ruolo importante nella diagnosi ante mortem della rabbia umana. Diversi test basati su PCR sono stati valutati per integrare i test convenzionali per diagnosi di rabbia ante mortem e post mortem ^7,8,9,10. La maggior parte dei saggi ha come obiettivo il gene della nucleoproteina virale della rabbia per l’amplificazione, che è la regione più conservata nel genoma^{virale 1,11}. Negli ultimi 20 anni, vari saggi molecolari sono stati sviluppati per diagnosticare rabv, e alcuni di questi test sono stati utilizzati per la caratterizzazione del virus. La maggior parte degli studi ha mirato a rilevare geni conservati all’interno del genoma virale, più comunemente utilizzando test convenzionali o quantitativi di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)^12,13.

La PCR è una tecnica diagnostica altamente sensibile in grado di rilevare il genoma di un dato agente patogeno all’interno dei tessuti, anche quando questi tessuti sono decomposti. Utilizzando approcci basati su PCR, quantità minime di un agente infettivo possono essere rilevate in un campione clinico attraverso l’amplificazione selettiva e ripetitiva di una sequenza nucleotidica del DNA¹⁴. qRT-PCR che incorpora sonde fluorescenti (ad esempio, TaqMan) o coloranti leganti il DNA (ad esempio, SYBR Green) è stato utilizzato in studi per diagnosticare RABV sia ante– che post– mortem ad alta sensibilità; tuttavia, tale approccio richiede attrezzature specializzate. Per superare questa limitazione, è stata suggerita l’amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP), basata sul suo basso costo, semplicità e caratteristiche desiderabili per il rilevamento di RABV. Questo saggio è particolarmente importante in quanto può essere utilizzato nei paesi in via di^{sviluppo 15}.

qRT-PCR si basa sul rilevamento e la quantificazione di una molecola, dove gli aumenti del segnale fluorescente sono in proporzione diretta alla quantità di prodotto PCR in una singola reazione. Con l’aumentare del numero di copie del bersaglio dell’acido nucleico, aumenta anche la fluorescenza. Coloranti intercalanti non specifici come il colorante SYBR Green per legare il DNA o sonde oligonucleotidi specifiche della sequenza che trasportano un fluoroforo e un quencher sono comunemente usati per fornire la lettura fluorescente in qRT-PCR. Questo test offre vantaggi rispetto all’RT-PCR convenzionale che include un tempo di test più breve (2-4 ore), un rischio ridotto di contaminazione a causa del sistema a tubo chiuso (mancanza di manipolazione post-PCR di prodotti amplificati) e la capacità di rilevare diversi obiettivi^{contemporaneamente 16}. qRT-PCR può essere utilizzato per diagnosticare la rabbia ante mortem dalla saliva e da altri campioni. Questo saggio può anche essere utilizzato come test universale in tempo reale per il rilevamento di diverse specie di Lyssavirus o lignaggi di RABV¹⁵. In questo approccio combo RT-PCR, vengono utilizzate due reazioni. Il primo rileva diversi linaggi genetici della RABV, e il secondo rileva le specie di Lyssavirus. Entrambi i passaggi coinvolgono test qRT-PCR, in cui il primo utilizza sonde di ibridazione e il secondo utilizza coloranti¹⁵. A causa del gran numero di test che hanno dimostrato il successo del rilevamento molecolare del RABV utilizzando questa tecnica, l’attuale manuale terrestre OIE (2018) raccomanda l’uso della PCR per il rilevamento molecolare di RABV¹⁷.

Il Messico è un paese con un notevole potenziale zootecnico. Gli stati con la più alta produzione di bestiame contengono sia regioni tropicali umide che regioni secche che sono a rischio di epidemie di rabbia a causa della presenza del pipistrello vampiro Desmodus rotundus, il principale trasmettitore della rabbia. Pertanto, è essenziale sviluppare più strumenti per la prevenzione e il controllo della rabbia paralitica bovina (BPR) in Messico. Sulla base di ciò, lo scopo di questo studio era quello di utilizzare qRT-PCR quantitativo per determinare il numero di particelle virali in diverse strutture anatomiche del cervello bovino dopo la morte a causa di un’infezione da rabbia.

Sei cervelli ottenuti da bovini positivi alla RABV sono stati donati da un laboratorio esterno per l’uso nello sviluppo del protocollo qRT-PCR descritto di seguito. I campioni della struttura cerebrale bovina sono stati trasportati a catena fredda presso l’impianto INIFAP CENID-MA laboratorio BSL-2 e conservati a -80 °C fino all’uso. I cervelli erano ottenuti da animali provenienti dagli stati di Campeche, Yucatán e Querétaro. Prima della ricezione, varie strutture venivano sezionate dal cervello. Queste strutture includevano il corno di Ammon, il cervelletto, la corteccia, il midollo, i pons e il talamo^18,19. Il materiale genetico è stato estratto come descritto di seguito. La diagnosi di RABV è stata confermata utilizzando anticorpi fluorescenti diretti (DFA)²⁰. Come controllo positivo, sono stati utilizzati cervelli di topo inoculati con RABV^21. Inoltre, quattro cervelli bovini negativi alla RABV (come determinato dal DFA) sono stati utilizzati come controlli negativi.

Protocol

Questo studio è stato approvato e condotto in stretta conformità con le raccomandazioni per l’uso di animali fornite dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA). 1. Campioni Utilizzare diverse aree del cervello sezionate da 6 diversi cervelli bovini positivi alla rabbia per l’analisi RT-PCR. 2. Anticorpi fluorescenti diretti (DLA) per conf…

Representative Results

I risultati del DFA hanno mostrato rispettivamente 100%, 100%, 83,3%, 66% e positività del 50% per rabv nella corteccia, talamo, midollo, pons e corno. Questi risultati hanno confermato i risultati precedenti, e almeno tre delle strutture sezionate da ogni cervello erano positive per rabv. Una colorazione DAF positiva rappresentativa è mostrata nella figura 1. La figura 2 mostra l’amplificazione di un frammento del gene RABV N (fase…

Discussion

Studi precedenti hanno dimostrato che il DFA può rilevare rabv solo entro sette giorni dalla conservazione del campione a temperatura ambiente (21 °C)¹⁴. Al contrario, questo lavoro ha dimostrato che la sensibilità di RT-PCR inizia a diminuire dopo che i campioni sono stati esposti alla temperatura ambiente per 12 giorni. Pertanto, il genoma RABV può essere rilevato da qRT-PCR in campioni esposti a temperatura ambiente per un massimo di 23 giorni. Ciò dimostra che la sensibilità di qRT-PCR ?…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.