狂犬病病毒在各种牛脑结构中的量化

Summary

该协议提出了一个基于qRT-PCR的方法，用于使用体外转录确定各种牛脑解剖结构中的狂犬病病毒核蛋白（N）基因拷贝编号。

Abstract

牛麻痹狂犬病（BPR）是一种病毒性脑炎，在整个拉丁美洲具有重要的经济意义，在那里它构成了严重的人畜共患风险。在这里，我们的目标是利用实验室协议，使用定量实时反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）确定不同牛脑解剖结构中狂犬病病毒（RABV）基因组的相对拷贝数。qRT-PCR 根据放大后释放的荧光来量化样品中存在的基因拷贝的具体数量，该副本与样品中的目标核酸含量成正比。与其他技术相比，这种方法的持续时间短、污染风险降低以及在不同样品中更容易检测病毒核酸的潜力是有利的。六只疯动物的大脑被分成六个解剖结构，即艾蒙的角、小脑、皮层、美杜拉、庞斯和塔拉穆斯。根据直接免疫荧光测试，所有大脑均被确认为RABV抗原阳性。还评估了四头RABV阴性牛大脑中相同的解剖结构。RNA 从每个结构中提取，用于 qRT-PCR。使用体外转录核蛋白基因进行检测以确定RABV基因的拷贝数。用于量化病毒RNA的标准曲线的效率为100%，线性为0.99。分析表明，皮层、梅杜拉和塔拉穆斯是用于RABV检测的理想CNS部分，其依据是这些结构拥有最高水平的RABV。测试特异性为100%。所有样本均呈阳性，未检测出误报。此方法可用于在 BPR 诊断过程中检测含有低水平 RABV 的样品中的 RABV。

Introduction

狂犬病可以通过各种技术进行确认，从而检测大脑、皮肤、尿液或唾液中的病毒核酸^。狂犬病病毒核蛋白（N）基因的检测主要用于通过分子测试诊断狂犬病。这种基因也用于病毒基因化。狂犬病可以在动物中使用受影响的大脑的任何部分进行诊断：然而，为了排除狂犬病的可能性，必须测试来自大脑中至少两个区域的组织^。动物狂犬病检测有几种诊断方法：然而，直接免疫荧光测试仍然是标准参考技术^3。其他测试包括生物测试，包括小鼠接种，组织培养感染，聚合酶链反应^{（PCR）4。}世界卫生组织（世卫组织）和世界动物卫生组织（OIE）^分别推荐了所有这些技术用于人类和动物狂犬病的诊断。

核酸检测和扩增^{技术近年来对}狂犬病的诊断进行了革命性变革，这些技术在人类狂犬病的尸检诊断中发挥了重要作用。已评估了数项基于PCR的测试，以补充常规的验尸和验尸狂犬病诊断^{7、8、9、10。}大多数检测目标狂犬病病毒核蛋白基因放大，这是病毒基因组^1，11中保存最高度的地区。在过去20年中，已经开发出各种分子检测来诊断RABV，其中一些检测结果被用于病毒特征分析。大多数试验都旨在检测病毒基因组中的保存基因，最常见的是使用常规或定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测^12，13。

PCR 是一种高度敏感的诊断技术，即使在这些组织分解时，也能检测组织内特定病原体的基因组。使用基于PCR的方法，通过DNA核苷酸序列¹⁴的选择性和重复放大，可以在临床样本中检测到少量的传染性药物。qRT-PCR，结合荧光探头（如塔克曼）或DNA结合染料（如SYBR绿色）已用于试验诊断RABV前-和后–验尸具有高灵敏度;然而，这种方法需要专门的设备。为了克服这一限制，建议基于RABV检测的低成本、简单性和可取特性，反向转录循环介质同热放大（RT-LAMP）。这种检测是特别重要的，因为它可以在发展中国家^使用15。

qRT-PCR 基于分子的检测和定量，荧光信号的增加与单个反应中的 PCR 产品量成正比。随着核酸靶的拷贝数量增加，荧光也增加。非特定的交错染料，如 SYBR 绿色 DNA 结合染料或带有氟磷和淬火器的序列特异性寡核苷酸探针，通常用于在 qRT-PCR 中提供荧光读出。此检测比传统的 RT-PCR 具有优势，包括更短的测试时间 （2–4 h）、由于封闭管系统（缺乏对放大产品的 PCR 后操作）导致的污染风险，以及同时检测不同目标^{的能力 16}。qRT-PCR 可用于从唾液和其他样本中诊断狂犬病前发现。此检测还可用于检测 RABV¹⁵的不同Lyssa 病毒物种或血统的通用实时测试。在此组合 RT-PCR 方法中，使用两种反应。第一个检测RABV的不同遗传亚麻，第二个检测莱萨病毒物种。这两个步骤都涉及 qRT-PCR 检测，其中第一个使用杂交探头，第二个使用染料¹⁵。由于大量测试证明使用这种技术成功检测RABV分子，目前的OIE地面手册（2018年）建议使用PCR进行RABV¹⁷的分子检测。

墨西哥是一个具有巨大牲畜潜力的国家。牲畜产量最高的州包括潮湿的热带地区和干旱地区，由于存在狂犬病的主要传播者吸血鬼蝙蝠 Desmodus轮回病毒， 这些地区都面临狂犬病爆发的风险。因此，必须开发更多的工具，预防和控制墨西哥的牛麻痹狂犬病。在此基础上，本研究的目的是使用定量qRT-PCR来确定牛脑不同解剖结构中因狂犬病感染而死亡后病毒颗粒的数量。

从RABV阳性牛获得六个大脑是由外部实验室捐赠的，用于开发下文所述的qRT-PCR协议。牛脑结构样本被冷链运送到INIFAP CENID-MA实验室BSL-2设施，储存在-80°C，直到使用。大脑来自坎佩切州、尤卡坦州和克雷塔罗州的动物。在收到之前，从大脑中解剖了各种结构。这些结构包括埃蒙的角，小脑，皮层，美杜拉，庞斯和塔拉穆斯^18，19。遗传物质提取如下所述。RABV诊断被证实使用直接荧光抗体^{（DFA）20。}作为一种积极的控制，使用用RABV²¹接种的老鼠大脑。此外，四个RABV阴性牛脑（由DFA确定）被用作负控制。

Protocol

这项研究是严格按照国家动物保护与使用委员会（动物研究所）提供的动物使用建议批准和进行的。 1. 样品 使用从 6 种不同的狂犬病阳性牛脑解剖的大脑的不同区域进行 RT-PCR 分析。 2. 直接荧光抗体（DFAs）确认狂犬病 注：DFA检测狂犬病抗原是一种定性方法，使用荧光素标记的抗体确定狂犬病核蛋白的存在。测试是使用Dean…

Representative Results

DFA结果显示，RABV在皮层、沙拉穆斯、美杜拉、庞斯和角中的积极性分别为100%、100%、83.3%、66%和50%。这些结果证实了先前的结果，从每个大脑中解剖出的结构中至少有三个对RABV呈阳性。 图1显示了具有代表性的阳性DAF染色。 图2 显示了RABV N基因片段的放大（第5.5步），引体由洛扎-鲁比奥等人等11人报告。这表明，?…

Discussion

先前的研究表明，DFA只能在样品在室温（21^°C）14下储存后7天内检测到RABV。相比之下，这项工作表明，在样品暴露在室温下12天后，RT-PCR的灵敏度开始降低。因此，RABV 基因组可以通过 qRT-PCR 在暴露在室温下的样品中检测到长达 23 天。这表明，对于更高分解的样品，qRT-PCR 的灵敏度相对较高。然而，仍然有必要开发更简单的方法，不损害具体性^25。目前的研究表?…

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.