Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği
Summary
Bu protokol, in vitro transkripsiyon kullanarak çeşitli sığır beyin anatomik yapıları içindeki kuduz virüsü nükleoprotein (N) gen kopya numarasını belirlemek için qRT-PCR tabanlı bir yaklaşım sunar.
Abstract
Sığır paralitik kuduz (BPR), büyük bir zoonotik risk oluşturduğu Latin Amerika’da önemli ekonomik öneme sahip bir viral ensefalit şeklidir. Burada amacımız, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklı sığır beyin anatomik yapılarında kuduz virüsü (RABV) genomunun bağıl kopya numarasını belirlemek için bir laboratuvar protokolü kullanmaktı. qRT-PCR, bir numunede bulunan belirli gen kopyalarının sayısını, örnekte bulunan hedef nükleik asit miktarıyla doğru orantılı olan amplifikasyondan sonra yayılan floresan bazlı olarak ölçendir. Bu yöntem, kısa süresi, kontaminasyon riskinin azalması ve farklı numunelerdeki viral nükleik asitleri diğer tekniklere göre daha kolay tespit etme potansiyeli nedeniyle avantajlıdır. Altı kuduz hayvanın beyni altı anatomik yapıya, yani Ammon boynuzu, beyincik, korteks, medulla, pons ve talamusa ayrılmıştır. Doğrudan immünoresans testinde tüm beyinlerin RABV antijenleri için pozitif olduğu belirlendi. Dört RABV negatif sığırın beyninden elde edilen anatomik yapıların aynısı da değerlendirildi. RNA her yapıdan çıkarılmış ve qRT-PCR için kullanılmıştır. RABV genlerinin kopya numaralarını belirlemek için in vitro transkript edilmiş nükleoprotein geni kullanılarak bir test yapıldı. Viral RNA’yı ölçmek için kullanılan standart eğri% 100 verimlilik ve 0.99 doğrusallık gösterdi. Analizler, korteks, medulla ve talamusun, bu yapıların en yüksek RABV seviyelerine sahip olduğu gözlemine dayanarak, RABV tespitinde kullanılmak üzere ideal CNS bölümleri olduğunu ortaya koydu. Test özgüllüğü %100 idi. Tüm örnekler pozitif çıktı, yanlış pozitif tespit olmadı. Bu yöntem BPR tanısı sırasında düşük düzeyde RABV içeren örneklerde RABV’yi tespit etmek için kullanılabilir.
Introduction
Kuduz, beyin, cilt, idrar veya tükürükteki viral nükleik asitlerin tespitini sağlayan çeşitli tekniklerle ante-mortem ve post-mortem olarak doğrulanabilir1. Kuduz virüsü nükleoprotein(N)geninin tespiti öncelikle moleküler testlerle kuduz tanısı için kullanılır. Bu gen viral genotipleme için de kullanılır. Kuduz, etkilenen beynin herhangi bir bölümünü kullanarak hayvanlarda teşhis edilebilir; bununla birlikte, kuduz olasılığını dışlamak için, beyindeki en az iki bölgeden doku test edilmelidir2. Hayvanlarda kuduz tespiti için çeşitli tanı yöntemleri mevcuttur; bununla birlikte, doğrudan immünofluoresans testi standart referans tekniği olmaya devam etmektedir3. Diğer testler arasında fare aşılama, doku kültüründe enfeksiyon ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)4içeren biyolojik testler yer almaktadır. Tüm bu teknikler, insanlarda ve hayvanlarda kuduz tanısı için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) tarafından önerilmektedir, sırasıyla5.
Nükleik asit tespiti ve amplifikasyon teknikleri son yıllarda kuduz tanısında devrim sağlamıştır6 ve bu teknikler insan kuduzunun ante mortem tanısında önemli rol oynamaktadır. Ante-mortem ve post-mortem kuduz tanıları7,8,9,10için konvansiyonel testleri tamamlamak için çeşitli PCR tabanlı testler değerlendirilmiştir. Çoğu tahlil, viral genom 1,11’deen çok korunan bölge olan amplifikasyon için kuduz viral nükleoprotein genini hedefalmaktadır. Son 20 yılda RABV tanısı koymak için çeşitli moleküler tahliller geliştirilmiş ve bu testlerden bazıları virüs karakterizasyonu için kullanılmıştır. Çoğu çalışma, viral genomdaki korunmuş genleri tespit etmeyi amaçlamıştır, en yaygın olarak geleneksel veya nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) tahlillerikullanılarak 12,13.
PCR, bu dokular ayrıştığında bile dokular içindeki belirli bir patojenin genomlarını tespit edebilen son derece hassas bir tanı tekniğidir. PCR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, bir DNA nükleotid dizisinin seçici ve tekrarlayan amplifikasyonu yoluyla klinik bir örnekte minimum miktarda enfeksiyöz ajan tespit edilebilir14. floresan probları (örneğin, TaqMan) veya DNA bağlayıcı boyaları (örneğin, SYBR Green) içeren qRT-PCR, RABV’yi hem antehem de post– mortem’i yüksek hassasiyetle teşhis etmek için çalışmalarda kullanılmıştır; ancak, böyle bir yaklaşım özel ekipman gerektirir. Bu sınırlamayı aşmak için, RABV’nin tespiti için düşük maliyetine, basitliğine ve arzu edilen özelliklerine dayanarak ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) önerilmiştir. Bu tahlil özellikle gelişmekte olan ülkelerde kullanılabileceği için önemlidir15.
qRT-PCR, floresan sinyal artışlarının tek bir reaksiyondaki PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olduğu bir molekülün tespitine ve nicelleştirilmesine dayanır. Nükleik asit hedefinin kopyalarının sayısı arttıkça floresan da artar. SYBR Green DNA bağlayıcı boya veya florofor ve quencher taşıyan sıraya özgü oligonükleotid problar gibi spesifik olmayan interkaling boyalar genellikle qRT-PCR’deki floresan okumayı sağlamak için kullanılır. Bu tahlil, daha kısa bir test süresi (2-4 saat), kapalı tüp sistemi nedeniyle kontaminasyon riskinin azalması (güçlendirilmiş ürünlerin PCR sonrası manipülasyon eksikliği) ve aynı anda farklı hedefleri tespit etme yeteneğini içeren geleneksel RT-PCR’ye göre avantajlar sunar16. qRT-PCR, tükürük ve diğer örneklerden kuduz ante-mortem tanısı koymak için kullanılabilir. Bu test, farklı Lyssavirus türlerinin veya RABV15soylarının tespiti için evrensel bir gerçek zamanlı test olarak da kullanılabilir. Bu kombo RT-PCR yaklaşımında iki reaksiyon kullanılır. Birincisi RABV’nin farklı genetik linajlarını, ikincisi ise Lyssavirus türlerini tespit eder. Her iki adım da qRT-PCR tahlillerini içerir, burada ilki hibridizasyon probları kullanır ve ikincisi boyalarkullanır 15. Bu tekniği kullanarak RABV’nin başarılı bir şekilde moleküler olarak tespit edildiğini gösteren çok sayıda test sayesinde, mevcut OIE Karasal El Kitabı (2018), RABV17’ninmoleküler tespiti için PCR kullanılmasını önermektedir.
Meksika önemli hayvancılık potansiyeline sahip bir ülkedir. Hayvancılık üretiminin en yüksek olduğu eyaletler, kuduzun ana vericisi olan vampir yarasa Desmodus rotundus’un varlığı nedeniyle kuduz salgınları için risk altında olan hem nemli tropikal bölgeleri hem de kuru bölgeleri içerir. Bu nedenle, México’da sığır paralitik kuduzunun (BPR) önlenmesi ve kontrolü için daha fazla araç geliştirmek önemlidir. Buna dayanarak, bu çalışmanın amacı kuduz enfeksiyonuna bağlı ölümü takiben sığır beyinlerinin farklı anatomik yapılarındaki viral parçacıkların sayısını belirlemek için nicel qRT-PCR kullanmaktı.
RABV pozitif sığırlardan elde edilen altı beyin, aşağıda açıklanan qRT-PCR protokolünün geliştirilmesinde kullanılmak üzere harici bir laboratuvar tarafından bağışlanmıştır. Sığır beyin yapısı örnekleri inifap CENID-MA laboratuvarı BSL-2 tesisine soğuk zincirle taşınmış ve kullanıma kadar -80 °C’de saklanmıştır. Beyinler Campeche, Yucatán ve Querétaro eyaletlerindeki hayvanlardan elde edildi. Makbuzdan önce, beyinlerden çeşitli yapılar parçalandı. Bu yapılar Ammon boynuzu, serebellum, korteks, medulla, pons ve talamus18,19’uiçeriyordu. Genetik materyal aşağıda açıklandığı gibi çıkarılmıştır. RABV tanısı doğrudan floresan antikorlar (DFA) kullanılarak doğrulandı20. Pozitif kontrol olarak RABV21 ile aşılanmış fare beyinleri kullanılmıştır. Ayrıca, dört RABV negatif sığır beyni (DFA tarafından belirlendiği gibi) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalar, DFA’nın RABV’i sadece numunenin oda sıcaklığında (21 °C)14’tedepolanmasının yedi gün içinde tespit dabileceğini göstermiştir. Buna karşılık, bu çalışma, numuneler 12 gün boyunca oda sıcaklığına maruz kaldıktan sonra RT-PCR’nin hassasiyetinin azalmaya başladığını göstermiştir. Bu nedenle RABV genom, 23 güne kadar oda sıcaklığına maruz kalan örneklerde qRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu, daha fazla ayrışmış numuneler için qRT-PCR duyar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Tarım, Ormancılık ve Hayvancılık Araştırmaları Enstitüsü (INIFAP) tarafından desteklendi. Jerzayn Fraustro Esquivel’e bu belgeyle ilişkili videonun geliştirilmesindeki işbirliği için teşekkür ederiz.
Materials
| Chloroform | SIGMA | C7559 | Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil. |
| DNA Clean & Concentrator-500 | Zimo | D4031 | The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations. |
| Ethanol | Amresco | 193-500 | Purification of nucleic acids |
| FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack | Roche | 3553400001 | High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes |
| GelDoc XR | BioRad | XR+ | Analyzes larger protein and DNA gels |
| GelRed | Biotium | 41003 | A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells. |
| iCycler Thermal Cycler Gradient | BioRad | 582BR | Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | BioRad | 1725141 | Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes |
| Isopropyl alcohol | Amresco | 0918-500 | Precipitation of nucleic acids |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28706 | QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-021 | Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand. |
| NanoDrop 2000 | Thermo-Scientific | ND2000 | Microvolume Spectrophotometer |
| Oligo(dT)18 primer | Invitrogen | SO132 | The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends. |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 | Promega | P1300 | In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | #EP0402 | Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples. |
References
- Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
- . CDC Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019)
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. , (1996).
- Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
- Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
- Singh, R., et al. Rabies – epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
- David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
- Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
- Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
- Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
- Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
- Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
- Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
- Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
- Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018)
- Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
- Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017)
- Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. , (1996).
- Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
- Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
- Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
- Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
- Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
- Fooks, A. R., et al. . Rabies. 3, 1-18 (2017).
- Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).
