Summary
L’application Exosome est un outil émergent pour le développement de médicaments et la médecine régénérative. Nous établissons un protocole d’isolement exosome avec une grande pureté pour isoler les exosomes de nouvelles cellules souches identifiées appelées CB-SC pour les études mécanistes. Nous coculture également cb-SC-dérivé exosomes avec des monocytes humains, conduisant à leur différenciation en macrophages phénotypiquement distincts.
Abstract
La thérapie d’éducateur de cellules souches (SCE) est une nouvelle approche clinique pour le traitement du diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes. La thérapie de SCE fait circuler les cellules mononucléaires de sang du patient isolé (par exemple, lymphocytes et monocytes) par une machine d’apheresis, co-cultures les cellules mononucléaires de sang du patient avec des cellules souches adhérentes dérivées du sang de cordon ombilical (CB-SC) dans le dispositif de SCE, et retourne alors ces cellules immunitaires « instruites » au sang du patient. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de taille nanométrique entre 30\u2012150 nm existant dans tous les médias biofluidés et de culture cellulaire. Pour explorer davantage les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thérapie SCE et déterminer les actions des exosomes libérés par CB-SC, nous étudions quelles cellules phagocytisent ces exosomes pendant le traitement par CB-SC. En co-culturant les exosomes dérivés du CB-SC étiquetés PAR Dio avec les cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC), nous avons constaté que les exosomes dérivés du CB-SC étaient principalement pris en charge par des monocytes humains CD14 positifs, conduisant à la différenciation des monocytes en macrophages de type 2 (M2), avec morphologie spindle-like et expression des marqueurs moléculaires de surface associés à M2. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la caractérisation des exosomes cb-SC-dérivés et le protocole pour la co-culture des exosomes CB-SC-dérivés avec les monocytes humains et la surveillance de la différenciation M2.
Introduction
Les cellules souches du sang de cordon ombilical (CB-SC) sont un type unique de cellules souches identifiées à partir du sang de cordon ombilical humain et se distinguent d’autres types connus de cellules souches telles que les cellules souches mésenchymales (MSC) et les cellules souches hématopoïétiques (HSC)1. En fonction de leurs propriétés uniques de modulation immunitaire et de leur capacité à adhérer étroitement à la surface des boîtes de Pétri, nous avons développé une nouvelle technologie désignée comme thérapie d’éducateur de cellules souches (SCE) dans les essaiscliniques 2,3. Pendant la thérapie de SCE, les cellules mononucléaires périphériques de sang d’un patient (PBMC) sont rassemblées et distribuées par un séparateur cellulaire et co-cultivés avec le CB-SC adhérent in vitro. Ces cellules « instruites » (CB-SC-traitées PBMC) sont alors retournées à la circulation du patient dans un système à boucle fermée. Les essais cliniques ont déjà démontré l’innocuité clinique et l’efficacité de la thérapie SCE pour le traitement des maladies auto-immunes, y compris le diabète de type 1 (T1D)2,4 et l’alopécie areata (AA)5.
Les exosomes sont une famille de nanoparticules dont le diamètre est de 30\u2012150 nm et existent dans tous les médias biofluides et de culture cellulaire6. Les exosomes sont enrichis de nombreuses molécules bioactives, y compris les lipides, les ARNM, les protéines et les microARN (miARN), et jouent un rôle important dans les communications cellule à cellule. Ces derniers temps, les exosomes sont devenus plus attrayants pour les chercheurs et les compagnies pharmaceutiques en raison de leur potentiel thérapeutique dans les cliniques7,8,9. Récemment, nos études mécanistes ont démontré que les exosomes CB-SC-libérés contribuent à la modulation immunisée de la thérapie de SCE10.
Ici, nous décrivons le protocole pour explorer le mécanisme de la thérapie de SCE ciblant des monocytes par des exosomes CB-SC-libérés. Premièrement, les exosomes libérés par CB-SC ont été isolés des supports conditionnés dérivés du CB-SC à l’aide de méthodes d’ultracentrifugation et validés par cytométrie d’écoulement, tache occidentale (WB) et diffusion dynamique de la lumière (DLS). Deuxièmement, les exosomes dérivés de CB-SC ont été étiquetés avec un colorant lipophile fluorescent vert : Dio. Troisièmement, ils ont été co-cultivés avec PBMC pour examiner les pourcentages positifs d’exosomes dérivés de CB-SC étiquetés Dio aux différentes sous-populations de PBMC par cytométrie de flux. Ce protocole fournit des conseils pour étudier l’action des exosomes sous-jacents à la modulation immunitaire des cellules souches.
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Protocol
Le protocole suit les lignes directrices du comité institutionnel d’éthique de la recherche humaine au Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Des unités humaines de sang de manteau buffy ont été achetées du centre de sang de New York (New York, NY). Des unités humaines de sang de cordon ombilical ont été recueillies auprès de donneurs en bonne santé et achetées auprès de la banque de sang Cryo-Cell International (Oldsmar, FL). Le New York Blood Center et Cryo-Cell ont tous deux reçu toutes les accréditations pour les collectes et les distributions de sang, avec l’approbation de la CISR et les formulaires de consentement signés par les donneurs.
1. Culture cellulaire et préparation d’un milieu conditionné dérivé du CB-SC
- Transférer 25 mL de sang de cordon ombilical (tableau desmatériaux)sur 20 mL de dénivelé moyen (γ = 1,077) dans un tube conique de 50 mL.
- Centrifugeuse à 1 690 x g pendant 20 min à 20 °C dans un rotor balançant sans frein.
- Transférer délicatement la couche cellulaire mononucléaire (pelage bouffi) dans un nouveau tube conique de 50 mL. Remplir le tube conique de saline tamponnée de phosphate (PBS) à 40 mL. Mélanger et centrifugeuser les cellules à granulés à 751 x g pendant 10 min à 20 °C.
- Jetez le supernatant et ajoutez 15 mL de tampon de lyse ACK(Tableau des matériaux)à la pastille cellulaire. Suspendre à nouveau les cellules par pipetage. Puis incuber pendant 10 min à température ambiante.
REMARQUE : Cette étape élimine les globules rouges. - Remplissez le tube conique de 25 mL de PBS. Centrifugeuse à 751 x g pendant 5 min et jeter le surnatant pour obtenir des cellules mononucléaires granulées.
- Laver 2x avec 40 mL de PBS pour enlever le tampon de lyse restant.
- Centrifugeuse à 751 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules.
- Jetez le supernatant et suspendez les cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical avec 10 mL de milieu sans sérum défini chimiquement (Tableau des matériaux) par tube.
- Mélanger les cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical à un seul tube.
- Prendre 20 μL de suspension cellulaire et mélanger avec 20 μL de 0,4% trypan solution bleue (Table of Materials) dans un tube de 1,5 mL.
- Chargez dans la glissière de chambre et quantifiez le numéro de cellule et la viabilité de la cellule avec un compteur de cellules automatisé.
REMARQUE : La suspension cellulaire est diluée à 1:10 si la concentration cellulaire est supérieure à 1 x 107 cellules/mL. - Cellules mononucléaires de graine dans les plats de Petri de 150 mm x 15 mm à 1 x10 6 cellules/mL, 25 mL/plat dans le milieu chimique-défini de culture cellulaire sérique-libre.
- Incuber à 37 °C sous 8 % de CO2 pendant 10\u201214 jours jusqu’à ce que le CB-SC atteigne plus de 80 % de confluence.
- Jeter le surnatant et laver avec 15 mL de PBS par boîte de Pétri; puis, retirez le PBS.
REMARQUE : Cb-SC sont attachés aux plats de Petri étroitement. - Répétez l’étape 1.14 deux fois.
- Ajouter 25 mL de sérum moyen sans sérum défini chimiquement par boîte de Pétri.
- Incuber à 37 °C sous 8% de CO2 pendant 3\u20124 jours.
- Recueillir le milieu conditionné dérivé du CB-SC en tubes coniques de 50 mL.
2. Caractérisation du CB-SC
- Détachez CB-SC en pipetant 10 mL de tampon de dissociation cellulaire à base de PBS de haut en bas avec une pointe pipette de 5 mL (Tableau des matériaux).
- Centrifugeuse à 1 690 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules et suspendre à nouveau en 200 μL de PBS.
- Fixer et perméabilizer les cellules pour la coloration intracellulaire par l’intermédiaire du kit de préparation de coloration (Tableau des matériaux).
- Ajouter 5 μL de bloqueur fc(table des matériaux)par échantillon et incuber pendant 15 min à température ambiante.
REMARQUE : Le bloqueur fc inhibe la liaison non spécifique lors de la coloration avec des anticorps. - Ajouter des anticorps monoclonaux anti-humains conjugués à la fluorescence, y compris cd34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 et Galectin 9 à 25 μg/mL(tableau des matériaux)à 100 μL de volume de cellules. Incuber pendant 30 min à température ambiante avec protection contre la lumière.
- Après coloration, laver les cellules avec 1 mL de PBS et centrifugeuse à 751 x g pendant 10 min pour pelleter les cellules.
- Suspendre à nouveau les cellules avec 200 μL de PBS et les transférer dans un tube de 5 mL.
- Effectuer la cytométrie d’écoulement pour valider l’expression de CB-SC-associé au-dessus des marqueurs spécifiques.
3. Isolement des exosomes dérivés du CB-SC
- Centrifugeuse le milieu conditionné recueilli à partir de l’étape 1.18 à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
- Centrifugeuse le supernatant recueilli à partir de l’étape 3.1 à 2.000 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
- Centrifugeuse le supernatant recueilli à partir de l’étape 3.2 à 10.000 x g pendant 30 min à 4 °C. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 mL.
REMARQUE : Le rotor à angle fixe est utilisé de sorte que les granulés cellulaires soient précipités sur le côté du tube. Marquez le côté du bouchon et dessinez un cercle sur le côté du tube où la pastille est attendue. - Filtrez les supernatants recueillis à partir de l’étape 3.3 avec un filtre de 0,22 μm(Tableau des matériaux).
- Transférer 15 mL de supports à chaque unité de filtre centrifuge de 10 kDa (Tableau des matériaux).
- Centrifugeuse à 4000 x g pendant 30 min pour isoler les médias exosome concentrés.
- Transférer les exosomes concentrés dans un tube d’ultracentrifugeuse. Puis, exosomes granulés à 100.000 x g pendant 80 min à 4 °C.
- Jeter le supernatant et suspendre à nouveau les exosomes de granulés dans 10 mL de PBS.
- Centrifugeuse à 100.000 x g pendant 80 min à 4 °C pour recueillir les exosomes granulés.
- Suspendre à nouveau la pastille d’exosomes dans 200 μL de PBS en faisant monter et descendre.
4. Caractérisation des exosomes dérivés du CB-SC
- Quantification de la concentration totale en protéines de préparation exosome par kit d’analyse d’acide bicinchoninique (BCA)
- Pipette 10 μL de chaque échantillon standard d’albumine et exosome isolé préparé à l’étape 3.10 dans une plaque de 96 puits en double.
- Ajouter 200 μL du reagent de travail du kit BCA à chaque puits. Bien mélanger le contenu de l’assiette sur le shaker de l’assiette pendant 10 s.
REMARQUE : Reagent de travail (WR) : 50 parties de reagent A avec 1 partie de reagent B. - Couvrir les assiettes de papier d’aluminium et les incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Refroidir les assiettes à température ambiante (RT).
- Mesurer l’absorption de l’échantillon à 562 nm par l’intermédiaire d’un lecteur de plaque.
- Préparation et coloration des exosomes pour la cytométrie du débit
- Capturez les exosomes en ajoutant 20 μL de perles magnétiques anti-humains CD63 (taille de 4,5 μm)(tableau des matériaux)en 25 μg d’exosomes dérivés du CB-SC préparés à l’étape 3.10 dans un volume total de 100 μL de PBS.
- Incuber le tube toute la nuit (18\u201222 h) à 4 °C sur le shaker à 800 rpm.
- Centrifugeuse du tube à 300 x g pendant 30 s pour recueillir l’échantillon au fond du tube.
- Ajouter 300 μL de tampon d’isolement (0,1 % d’albumine de sérum bovin (BSA) dans PBS) et mélanger délicatement à l’aide d’un pipetage.
REMARQUE : Cette étape lave les exosomes liés aux perles. - Placez le tube sur un support magnétique pendant 1 min (Table des Matériaux) et jetez le supernatant.
- Répétez les étapes 4.2.4\u20124.2.5.
- Suspendre à nouveau les exosomes liés aux perles avec 400 μL de tampon d’isolement.
- Aliquot 100 μL d’exosomes liés aux perles à chaque tube.
- Ajouter des anticorps conjugués à la fluorescence (CD9-FITC, CD81-PE et CD63-FITC à 25 μg/mL, respectivement) à chaque tube d’écoulement avec des exosomes capturés par des perles CD63.
REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôles négatifs. - Incuber pendant 45 min à température ambiante avec une protection légère sur le shaker à 800 rpm.
- Répétez les étapes 4.2.4\u20124.2.5.
- Suspendre à nouveau les exosomes liés aux perles dans 200 μL de tampon d’isolement et les transférer vers des tubes d’écoulement de 5 mL.
- Placer les tubes dans le carrousel échantillon du cytomètre d’écoulement.
- Ouvrez le protocole pour les tests exosome.
- Exécutez l’échantillon automatiquement par cytomètre d’écoulement.
- Détection exosome par tache occidentale
REMARQUE: Tache occidentale est une méthode bien établie et nous n’allons pas entrer dans les détails de la méthode elle-même.- Lyse les granulés d’exosomes dérivés de CB-SC de l’étape 3.10 avec 100 μL de tampon RIPA, pipette 20x, puis placer sur la glace pendant 5 min.
- Quantifier la concentration protéique de lysate exosome par kit BCA et charger 25 μg de protéines par puits.
- Séparer les protéines par électrophorésie gel pendant 40 min à 150 V.
- Transférer la protéine à la membrane du fluorure de polyvinylidene (PVDF) à l’aide de la méthode de transfertsemi-sèche 11.
- Bloquer la membrane avec 5% de lait non gras pendant 30 min.
- Incuber avec 2 anticorps anti-humains Alix(Tableau des matériaux)et 1 anticorps anti-humains calnexine μg/mL (Tableau des matériaux).
- Détectez la protéine par chimioluminescence à l’aide d’un système d’imagerie numérique.
- Validation exosome par diffusion dynamique de la lumière (DLS)
- Diluer 10 μg d’échantillons d’exosomes dérivés du CB-SC dans 1 mL de PBS.
- Transférer le 1 mL d’échantillon dilué dans une cuvette semi-micro jetable( Tableau des matériaux).
- Placez la cuvette dans l’instrument DLS. Définissez l’indice réfractif (RI) comme 1,39 pour tous les moniteurs d’échantillon.
- Exécutez des échantillons à 25 °C et obtenez trois mesures par fraction pour obtenir une distribution de taille moyenne.
- Validation exosome par microscopie électronique de transmission (TEM)
- Coat formvar sur 300 grilles de cuivre en maille12 (Tableau des matériaux).
- Renforcer le formvar avec la couche supplémentaire de carbone évaporé sur les grilles de cuivre12.
REMARQUE : Une telle approche de revêtement est excellente pour le support des spécimens. - Chargez 10 μL d’échantillons d’exosome sur les grilles et laissez sécher à l’air libre.
- Colorer négativement les échantillons d’acétate d’uranyle pendant 5 min.
- Laver trois fois avec de l’eau DI et laisser sécher à l’air libre.
- Observez et photographiez les échantillons sous TEM. Réglez la tension d’accélération à 200 kV et la taille de la tache à 2.
5. Mesurer les exosomes dérivés du CB-SC étiquetés Dio pris par différentes sous-populations de PBMC
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Étiquette exosomes dérivés du CB-SC avec colorant lipophile fluorescent vert Dio
- Transférer 100 μg d’exosomes dérivés du CB-SC (préparés à l’étape 3.10) dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Diluer l’échantillon avec PBS à 5 mL.
- Ajouter le colorant lipophile fluorescent vert Dio (Tableau desmatériaux) jusqu’àce que la concentration de travail atteigne 5 μM.
- Incuber pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière.
- Transférer l’échantillon dans un tube d’ultracentrifugeuse.
- Centrifugeuse à 100.000 x g pendant 80 min pour pelleter dio-étiqueté CB-SC-dérivé exosomes.
- Suspendre à nouveau les exosomes étiquetés dans 200 μL de PBS.
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Préparation du PBMC humain
- Transférer 25 mL de pelage buffy humain(Table of Materials)de plus de 20 mL de dénivelé moyen (γ = 1,077) dans un tube conique de 50 mL.
- Répétez les étapes 1.2 à 1.11.
- Transférer 1 x 106 PBMC dans une plaque hydrophobe hydrophobe non traitée par les tissus (1 mL/puits).
REMARQUE : Une plaque non traitée par les tissus a été utilisée pour éviter l’adhérence des monocytes.
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Co-culture Dio-labeled exosomes avec PBMC
- Transférer 40 exosomes dérivés du CB-SC étiquetés μL Dio préparés à l’étape 5.1.7 à chaque puits contenant PBMC dans une plaque de 24 puits à l’aide d’une pipette de 200 μL. Ajouter le même volume de PBS pour contrôler les puits.
- Mélanger en pipetting 10x. Incuber pendant 4 h.
- Recueillir 200 μL de PBMC traités à l’exosome et l’étiqueter avec Hoechst 33342 pendant 10 min à température ambiante.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS.
- Monter les cellules sur des diapositives au microscope.
- Observez et photographiez l’interaction d’exosomes dérivés du CB-SC étiquetés Dio avec hoechst 33342 étiquetés PBMC à l’aide d’un microscope.
- Transférer les cellules restantes de l’étape 5.3.3 dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 200 μL de PBS.
- Ajouter 5 μL de bloqueur Fc par échantillon. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter des anticorps (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 et CD56 à 25 μg/mL)(Table of Materials)pour tacher PBMC.
REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôles négatifs. - Incuber pendant 30 min à température ambiante avec protection contre la lumière.
- Ajouter 1 mL de PBS et de centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour pelleter les cellules.
- Suspendre à nouveau les cellules avec 200 μL PBS. Ajouter 5 μL d’iodure de propidium.
- Utilisez la cytométrie du débit pour évaluer le niveau d’absorption exosome étiquetée Dio dans différentes sous-populations de PBMC.
6. Examiner l’action des exosomes dérivés du CB-SC sur les monocytes
- Isolation des monocytes humains CD14 positifs
- Transférer 3 x 107 PBMC humain dans un tube de 15 mL.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Placez la colonne de séparation( Tableau des matériaux) dans le séparateur d’aimant ( Tableau desmatériaux).
- Laver les colonnes de séparation trois fois avec 2 mL de tampon de fonctionnement à froid( Tableau des matériaux).
- Suspendre à nouveau les cellules dans 300 μL de PBS froid. Ajouter 60 μL de microbilles de CD14. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter 6 mL de PBS froid. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Suspendre à nouveau les cellules granulées dans 500 μL de tampon de fonctionnement à froid.
- Transférez les cellules dans la colonne de séparation (préparées à l’étape 6.14) et laissez-les passer.
- Lavez la colonne de séparation trois fois avec 2 mL de tampon en cours d’exécution par lavage. Soulevez la colonne du séparateur d’aimant et placez-la dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
REMARQUE : Le tube de 15 mL doit être placé sur la glace en raison de l’adhérence des monocytes CD14 positifs au tube à température ambiante. - Transférez 2 mL de tampon de fonctionnement à froid vers le haut de la colonne et isolez les cellules CD14 positives dans le tube de 15 mL.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour pelleter les cellules CD14 positives.
- Suspendre à nouveau les cellules avec 2 mL de sérum froid défini chimiquement milieu libre (Tableau des matériaux).
- Transférer 50 μL de cellules dans un tube de 1,5 mL.
- Tache avec 10 μL de Krome Orange conjuguée anti-humain CD14 mAb (Table of Materials) pendant 20 min.
REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôles négatifs. - Ajouter 1 mL PBS aux cellules. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min pour pelleter les cellules.
- Suspendre à nouveau les cellules dans 200 μL de PBS et les transférer dans un tube de 5 mL. Déterminer la pureté des monocytes CD14 positifs par cytométrie d’écoulement.
- Traitement des monocytes avec des exosomes dérivés du CB-SC
- Graine 1 x 106 monocytes purifiés avec milieu de culture sans sérum défini chimiquement (Tableau des matériaux) dans la plaque de 6 puits traitée par culture tissulaire (2 mL/puits).
- Incuber pendant 2 h à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Jeter le supernatant avec une pipette de 1 mL. Ajouter délicatement 2 mL de 37 °C de milieu de culture sans sérum préchauffé défini chimiquement (Table of Materials).
REMARQUE : Les monocytes ont été adhérés à la plaque dans les 2 h. Les cellules flottantes ont été identifiées comme étant mortes ou d’autres contaminations cellulaires. - Ajouter 80 exosomes dérivés du CB-SC isolés de l’étape 3.10 aux cultures monocytes dans une plaque de 6 puits avec un volume total de 2 mL.
REMARQUE : Le même volume de PBS a été ajouté aux puits de contrôle. - Incuber à 37 °C sous 5% de CO2 pendant 3\u20124 jours.
- Photographiez la morphologie cellulaire à l’aide d’un microscope inversé à 200 × grossissement(Tableau des matériaux).
- Détachez les cellules en pipetage de haut en bas dans 1 mL d’un tampon de dissociation cellulaire à base de PBS avec 1 mL pipette pointe.
- Récoltez les cellules attachées restantes à l’aide d’un grattoir cellulaire.
REMARQUE : Puisque les monocytes primaires ou les macrophages différenciés se fixent étroitement, certaines cellules restent adhérées au fond après le traitement avec le tampon de dissociation. Par conséquent, ces cellules sont récoltées avec un grattoir cellulaire. - Recueillir les cellules à 1 690 x g pendant 5 min. Suspendre à nouveau les cellules dans 200 μL de PBS.
- Ajouter 5 μL de bloqueur Fc (25 μg/mL) pour bloquer la liaison non spécifique.
- Ajouter des anticorps (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209 à 25 μg/mL, Table of Materials)aux cellules. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE : Les IgGs appariés à l’isotype servent de contrôle négatif - Ajouter 1 mL de PBS aux cellules et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min. Jetez le supernatant et suspendez avec 200 μL de PBS.
- Ajouter 5 μL d’iodure de propidium par échantillon (200 μL) et transférer les cellules dans un nouveau tube d’écoulement de 5 mL.
- Effectuez la cytométrie du flux et évaluez les niveaux d’expressions CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209.
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Representative Results
Au commencement, le phénotype et la pureté du CB-SC ont été examinés par cytométrie de flux avec des marqueurs CB-SC-associés tels que l’antigène commun de leucocyte CD45, les facteurs de transcription cellule-spécifiques d’ES OCT3/4, et SOX2. Cb-SC afficher des niveaux élevés de CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, et galectin 9 expression, mais aucune expression de CD34 (Figure 1A). L’analyse de cytométrie de flux a confirmé l’expression des marqueurs exosome-spécifiques comprenant CD9, CD81, et CD63 étaient sur des exosomes CB-SC-dérivés (figure 1B). La morphologie et la répartition de la taille des exosomes ont été caractérisées par TEM et DLS (Figure 1C,D), avec la taille de 79,38 ± 20,07 nm. La tache occidentale a également prouvé l’expression du marqueur exosome-associé Alix, sans expression du marqueur ER-associé Calnexin (figure 1E).
PBMC ont été traités avec Dio-labeled CB-SC-Exo. L’observation de la microscopie a démontré l’interaction directe de CB-SC-Exo étiqueté Dio avec PBMC (Figure 2A). Afin de mieux définir la population cellulaire qui interagissait avec le CB-SC-Exo étiqueté Dio, différents compartiments cellulaires ont été fermés avec des marqueurs spécifiques aux cellules comme le CD3 pour les lymphocytes T, le CD11c pour les cellules dendritiques myéloïdes (DC), le CD14 pour les monocytes, le CD19 pour les cellules B et le CD56 pour les cellules NK(figure 2B). Après une incubation de 4 heures, la cytométrie de flux a démontré que différents compartiments de cellules sanguines se sont affichés à différentes intensités médianes de fluorescence (IMF) des exosomes dio-positifs (figure 2C). Notamment, les monocytes présentaient une intensité médiane de fluorescence plus élevée de CB-SC-Exo diio-positif que ceux d’autres cellules immunitaires (figure 2C), soulignant que les monocytes étaient principalement ciblés par les exosomes dérivés du CB-SC.
Pour explorer les effets directs des exosomes dérivés du CB-SC sur les monocytes, les CD14+ monocytes purifiés ont été co-cultivés avec des exosomes dérivés du CB-SC pendant 3 jours. Le monocyte traité par l’exosome s’est différencié avec succès en morphologies en forme de fuseau (Figure 3A). Ensuite, des phénotypes des monocytes traités ou non traités CB-SC-Exo ont été testés, révélant les expressions des marqueurs associés au M2, y compris le CD163, le CD206, le CD209, ont été nettement augmentés parmi le groupe traité par exosome(figure 3B, histogramme rouge). En comparaison avec les macrophages M2 conventionnels générés par M-CSF + IL-4, les monocytes traités par CB-SC-Exo ont exprimé des niveaux similaires de marqueurs associés au M2 tels que CD163, CD206, CD209, sans différences significatives (figure 3C). Par conséquent, les données indiquent que les monocytes se différencient en macrophages avec le phénotype M2 après le traitement avec des exosomes CB-SC-dérivés.
Figure 1 : Caractérisation des exosomes dérivés du CB-SC. (A) Caractérisation phénotypique de CB-SC, expression élevée de CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 et Galectin-9, aucune expression de CD34. (B) Expressions de marqueurs associés à l’exosome (CD63, CD9, CD81) sur les exosomes dérivés du CB-SC. Les IgGs appariés à l’isotype servaient de contrôles pour la cytométrie du débit (histogramme gris). (C) Image de microscopie électronique de transmission (TEM) des exosomes dérivés du CB-SC. (D) Distribution de taille des exosomes dérivés de CB-SC utilisant la diffusion de lumière dynamitique (DLS). (E) Les taches occidentales montrent que les exosomes cb-SC-dérivés affichent le marqueur exosome-spécifique Alix, mais négatif pour le marqueur endoplasmique réticulum (ER)-associé Calnexin. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Interaction des exosomes dérivés du CB-SC avec différentes populations de PBMC. (A) L’interaction de CB-SC-Exo étiqueté Dio (vert) avec PBMC (bleu, la coloration nucléaire avec Hoechst 33342) a été photographiée avec le microscope Nikon Eclipse Ti2 avec la version logicielle NIS-Elements 5.11.02, avec un grossissement élevé montrant la distribution d’exosomes étiquetés Dio (vert) dans les cellules PBMC après la co-incubation de 4 h 5 % de CO2 dans la plaque 24 puits traitée par culture non tissulaire. n = 2. (B) Stratégie de gating pour l’analyse de cytométrie de flux avec des marqueurs de surface spécifiques aux cellules pour différentes sous-populations dans PBMC, y compris le CD3 pour les lymphocytes T, le CD14 pour les monocytes, le CD19 pour les cellules B, le CD56 pour les cellules NK et le CD11c pour lesCD.( C ) Afficher différentes intensités médianes de fluorescence (IMF) de l’exosome étiqueté Dio parmi différentes sous-populations PBMC (p. ex., lymphocytes T, monocytes, cellules B, cellules NK, CD). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Effets des exosomes dérivés du CB-SC sur les monocytes. (A) Changement morphologique des monocytes dans les cellules spindle-like après traitement avec des exosomes CB-SC-dérivés. (B) Jusqu’à régulé le niveau d’expression des marqueurs associés M2 après le traitement avec des exosomes dérivés du CB-SC, tels que CD163, CD206 et CD209 (ligne rouge). Les monocytes non traités (ligne verte) servaient de contrôle. Les IgGs appariés à l’isotype servaient de contrôles négatifs (ligne grise). (C) Comparaison phénotypique entre les macrophages M2 conventionnels et les macrophages M2 induits par CB-SC-Exo. Pour générer les macrophages M2 conventionnels, les CD14+ monocytes purifiés ont été traités avec le facteur macrophage-stimulant de colonie de 50 ng/mL (M-CSF) à 37 °C, 5% des conditions de CO2 pendant 7 jours, et suivis du traitement de nuit avec 10 ng/mL IL-4. Marqueurs associés au M2, y compris CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 et CD209 ont été évalués par cytométrie de flux. L’immunoglobuline G (IgG) assortie à l’isotype sert de contrôle. Les données sont présentées comme des données ± SD; N = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’application d’exosomes est un domaine émergent pour le diagnostic clinique, le développement de médicaments et la médecine régénérative. Ici, nous présentons un protocole détaillé concernant la préparation des exosomes CB-SC-dérivés et l’étude fonctionnelle des exosomes sur la différenciation des monocytes humains. Le protocole actuel a démontré que les exosomes fonctionnels CB-SC-dérivés sont isolés par centrifugation séquentielle et ultracentrifugation avec la pureté élevée et présentant la modulation immunisée sur des monocytes.
Par rapport à d’autres protocoles conventionnels, l’ultrafiltration est une approche établie pour l’isolement et la purification des exosomes de différentes cellules ou médias, basée sur le poids moléculaire et les tailles d’exclusion qui sont différentes des autres vésicules extracellulaires (VE). Bien que l’isolement de l’ultrafiltration permette de gagner plus de temps que la séparation basée sur l’ultracentrifugation, il peut causer des dommages structurels aux vésicules de grandes tailles. Les exosomes peuvent également être recueillis par des précipitations médiées par le polyéthylène glycol (PEG) à faible coût, bien que cette méthode risque la pureté exosome due aux contaminations protéiques13,14. Par conséquent, le protocole actuel était rentable pour produire des exosomes à haute pureté. Basé sur les modulations immunitaires des exosomes CB-SC-dérivés10,la caractérisation des exosomes CB-SC-dérivés peut offrir un biomarqueur valable pour évaluer la puissance de l’éducateur de cellules souches avec CB-SC avant des applications cliniques.
Les macrophages sont des cellules professionnelles présentant des antigènes contre les infections virales et bactériennes, avec des fonctions biologiques et des hétérogénéités variées. En fonction de leurs différences dans les marqueurs de surface et la fonction immunitaire, les macrophages sont classés en deux sous-populations : les macrophages de type 1 (M1, macrophages conventionnels causant l’inflammation) et les macrophages de type 2 (M2, présentant une anti-inflammation)15. Cette étude a établi que les monocytes humains purifiés ont été différenciés en macrophages de type 2 après le traitement avec des exosomes CB-SC-dérivés, affichant un phénotype anti-inflammation10. Les monocytes exosome-traités cb-SC-dérivés ont exhibé la morphologie allongée et ont exprimé les marqueurs de surface M2-associés (par exemple, CD163, CD206, et CD209), avec le phénotype semblable que les macrophages M2 conventionnels générés utilisant des cytokines M-CSF + IL-4. Ces changements phénotypiques des monocytes mettent en évidence le nouveau mécanisme sous-jacent à la modulation immunitaire du CB-SC pour le traitement du diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes. Pendant la thérapie de SCE, les cellules immunitaires des patients ont été co-cultivés avec CB-SC pendant environ 8\u20129 h. Les monocytes traités par SCE ont ramené les exosomes cb-SC-dérivés dans le corps, qui ont contribué à la différenciation de M2 et à l’expansion de l’induction de la tolérance immunisée, menant à l’amélioration des résultats cliniques après le traitement avec la thérapie de SCE.
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Disclosures
M. Zhao est l’un des fondateurs de Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. M. Zhao est un inventeur de la technologie des éducateurs en cellules souches. Tous les autres auteurs n’ont aucun intérêt financier qui puisse être pertinent pour les travaux soumis.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à MM. Poddar et Ludwig pour leur généreux soutien financier par l’intermédiaire de la Fondation Hackensack UMC. Nous apprécions Laura Zhao pour le montage en anglais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
