Summary
Exosome Anwendung ist ein aufkommendes Werkzeug für die Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin. Wir etablieren ein Exosomen-Isolationsprotokoll mit hoher Reinheit, um Exosomen aus neuartigen identifizierten Stammzellen namens CB-SC für mechanistische Studien zu isolieren. Wir kokulturieren auch CB-SC-abgeleitete Exosomen mit menschlichen Monozyten, was zu ihrer Differenzierung in phänotypisch unterschiedliche Makrophagen führt.
Abstract
Die Stammzellpädagogin (SCE) therapie ist ein neuartiger klinischer Ansatz zur Behandlung von Typ-1-Diabetes und anderen Autoimmunerkrankungen. Die SCE-Therapie zirkuliert die mononukleären Blutzellen des isolierten Patienten (z. B. Lymphozyten und Monozyten) durch eine Apherese-Maschine, ko-kulturen die mononukleären Blutzellen des Patienten mit anhaftenden Nabelschnurblut-abgeleiteten Stammzellen (CB-SC) im SCE-Gerät und geben diese "gebildeten" Immunzellen dann in das Blut des Patienten zurück. Exosomen sind nanogroße extrazelluläre Vesikel zwischen 30 und 2012150 nm, die in allen Biofluid- und Zellkulturmedien vorhanden sind. Um die molekularen Mechanismen, die der SCE-Therapie zugrunde liegen, weiter zu erforschen und die Aktionen von aus CB-SC freigesetzten Exosomen zu bestimmen, untersuchen wir, welche Zellen diese Exosomen während der Behandlung mit CB-SC phagozytisieren. Durch die Co-Kultivierung von DIO-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) fanden wir heraus, dass CB-SC-abgeleitete Exosomen überwiegend von menschlichen CD14-positiven Monozyten aufgenommen wurden, was zur Differenzierung von Monozyten in Typ-2-Makrophagen (M2) mit spindelähnlicher Morphologie und Expression von M2-assoziierten Oberflächenmolekularmarkern führte. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen und das Protokoll für die Kokultur von CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit menschlichen Monozyten und die Überwachung der M2-Differenzierung vor.
Introduction
Cord-Blut-Stammzellen (CB-SC) sind einzigartige Stammzellen, die aus menschlichem Nabelschnurblut identifiziert wurden und sich von anderen bekannten Arten von Stammzellen wie mesenchymalen Stammzellen (MSC) und hämatopoetischen Stammzellen (HSC)1unterscheiden. Basierend auf ihren einzigartigen Eigenschaften der Immunmodulation und ihrer Fähigkeit, sich fest an der Oberfläche von Petrischalen zu halten, haben wir in klinischen Studien2,3eine neue Technologie entwickelt, die als Stammzellpädagoge (SCE)-Therapie bezeichnet wird. Während der SCE-Therapie werden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) eines Patienten gesammelt und durch einen Zellabscheider zirkuliert und mit dem angegobenen CB-SC in vitro kokultiviert. Diese "gebildeten" Zellen (CB-SC-behandelte PBMC) werden dann in einem geschlossenen Kreislaufsystem in den Kreislauf des Patienten zurückgeführt. Klinische Studien haben bereits die klinische Sicherheit und Wirksamkeit der SCE-Therapie zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen einschließlich Typ-1-Diabetes (T1D)2,4 und Alopecia areata (AA)5nachgewiesen.
Exosomen sind eine Familie von Nanopartikeln mit Durchmessern von 30 bis 2012150 nm und existieren in allen Biofluid- und Zellkulturmedien6. Exosomen sind mit vielen bioaktiven Molekülen angereichert, einschließlich Lipiden, mRNAs, Proteinen und microRNAs (miRNA), und spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation. In letzter Zeit sind Exosomen für Forscher und Pharmaunternehmen aufgrund ihrer therapeutischen Potenziale in Kliniken7,8,9attraktiver geworden. Kürzlich haben unsere mechanistischen Studien gezeigt, dass CB-SC-freigesetzte Exosomen zur Immunmodulation der SCE-Therapiebeitragen 10.
Hier beschreiben wir das Protokoll zur Untersuchung des Mechanismus der SCE-Therapie, die auf Monozyten durch CB-SC-freigesetzte Exosomen abzielt. Erstens wurden CB-SC-freigesetzte Exosomen mit Ultrazentrifugationsmethoden aus CB-SC-abgeleiteten konditionierten Medien isoliert und durch Durchflusszytometrie, Western Blot (WB) und dynamische Lichtstreuung (DLS) validiert. Zweitens wurden CB-SC-abgeleitete Exosomen mit einem grünen fluoreszierenden lipophilen Farbstoff gekennzeichnet: Dio. Drittens wurden sie gemeinsam mit PBMC kultiviert, um die positiven Prozentsätze von Dio-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen an den verschiedenen Subpopulationen von PBMC durch Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dieses Protokoll enthält Anleitungen zur Untersuchung der Wirkung von Exosomen, die der Immunmodulation von Stammzellen zugrunde liegen.
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Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien der ethikkommission für institutionelle Humanforschung am Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menschliche sbuffy Fell Bluteinheiten wurden vom New York Blood Center (New York, NY) gekauft. Menschliche Nabelschnurbluteinheiten wurden von gesunden Spendern gesammelt und von der Cryo-Cell International Blood Bank (Oldsmar, FL) gekauft. Sowohl das New York Blood Center als auch Cryo-Cell haben alle Akkreditierungen für Blutsammlungen und -verteilungen mit IRB-Genehmigung und unterzeichneten Zustimmungsformularen von Spendern erhalten.
1. Zellkultur und Vorbereitung von CB-SC-abgeleitetem konditionierten Medium
- 25 ml Nabelblut (Materialtabelle) über 20 ml Dichtegradientenmedium (γ = 1,077) in ein 50 ml konisches Rohr übertragen.
- Zentrifuge bei 1.690 x g für 20 min bei 20 °C in einem schwenkbaren Schaufelrotor ohne Bremse.
- Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht (Buffy Coat) vorsichtig auf ein neues 50 ml konisches Rohr. Füllen Sie das konische Rohr mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 40 ml. Mischen und Zentrifugieren zu Pelletzellen bei 751 x g für 10 min bei 20 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 15 ml ACK-Lysepuffer (Tabelle der Materialien) hinzu. Wiederhängen von Zellen durch Pipettierung. Dann für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Dieser Schritt entfernt die roten Blutkörperchen. - Füllen Sie das konische Rohr mit 25 ml PBS. Zentrifugieren Sie bei 751 x g für 5 min und entsorgen Überstand, um pelletierte mononukleäre Zellen zu erhalten.
- 2x mit 40 ml PBS waschen, um den verbleibenden Lysepuffer zu entfernen.
- Zentrifuge bei 751 x g für 5 min, um die Zellen zu pellet.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die mononukleären Nabelschnurblutzellen mit 10 ml chemisch-definiertem serumfreien Medium (Materialtabelle) pro Tube wieder auf.
- Kombinieren Sie Nabelschnurblut mononukleäre Zellen zu einer Röhre.
- Nehmen Sie 20 l Zellsuspension und mischen Sie mit 20 l 0,4% Trypan-Blau-Lösung(Materialtabelle) in einem 1,5 ml-Rohr.
- Laden Sie in den Kammerschlitten und quantifizieren Sie die Zellzahl und die Zelllebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler.
HINWEIS: Die Zellsuspension wird bei 1:10 verdünnt, wenn die Zellkonzentration über 1 x 107 Zellen/ml liegt. - Saat mononukleäre Zellen in 150 mm x 15 mm Petrischalen bei 1 x 106 Zellen/ml, 25 ml/Schale in chemisch-definiertem serumfreien Zellkulturmedium.
- Inkubieren Sie bei 37 °C unter 8%CO2-Bedingungen für 10 bis 201214 Tage, bis CB-SC mehr als 80% Zusammenfluss erreicht.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 15 ml PBS pro Petrischale; entfernen Sie dann die PBS.
HINWEIS: CB-SC sind eng an Petrischalen befestigt. - Wiederholen Sie Schritt 1.14 zweimal.
- Fügen Sie 25 ml chemisch definiertes Serumfreies Medium pro Petrischale hinzu.
- Inkubieren Bei 37 °C unter 8%CO2-Bedingungen für 3-u20124 Tage.
- Sammeln Sie das CB-SC-abgeleitete konditionierte Medium in 50 ml konische Rohre.
2. Charakterisierung von CB-SC
- Trennen Sie CB-SC, indem Sie 10 ml PBS-basierten Zelldissoziationspuffer mit einer 5 ml Pipettenspitze(Materialtabelle)nach oben und unten pipetieren.
- Zentrifuge bei 1.690 x g für 5 min zu Pelletzellen und wieder aufhängen in 200 l PBS.
- Fix und permeabilize Zellen für intrazelluläre Färbung über Färbung Vorbereitung Kit (Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 5 l Fc-Blocker(Materialtabelle) pro Probe hinzu und brüten 15 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Fc-Blocker hemmt unspezifische Bindung beim Färben mit Antikörpern. - Fügen Sie fluoreszenzkonjugierte Maus antihumane monoklonale Antikörper einschließlich CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 und Galectin 9 bei 25 g/ml (Materialtabelle)bis 100 L Zellvolumen hinzu. 30 min bei Raumtemperatur mit Lichtschutz bebrüten.
- Nach der Färbung Zellen mit 1 ml PBS und Zentrifuge bei 751 x g für 10 min zu Pelletzellen waschen.
- Wiederaufhängen von Zellen mit 200 l PBS und Übertragung in ein 5 ml Rohr.
- Führen Sie die Durchflusszytometrie durch, um die Expression von CB-SC-assoziierten über bestimmten Markern zu überprüfen.
3. Isolierung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen
- Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium ab Schritt 1,18 bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr.
- Zentrifugieren Sie den Überstand ab Schritt 3.1 bei 2.000 x g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr.
- Zentrifugieren Sie den Überstand ab Schritt 3.2 bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr.
HINWEIS: Der Festwinkelrotor wird verwendet, so dass die Zellpellets an der Seite des Rohres ausgefällt werden. Markieren Sie die Seite der Kappe und zeichnen Sie einen Kreis an der Seite des Rohres, wo das Pellet erwartet wird. - Filterüberstand, gesammelt ab Schritt 3.3 mit einem 0,22 m Filter (Materialtabelle).
- 15 ml Medien auf jede 10 kDa Zentrifugalfiltereinheit übertragen (Materialtabelle).
- Zentrifuge bei 4.000 x g für 30 min, um das konzentrierte Exosomenmedium zu isolieren.
- Übertragen Sie die konzentrierten Exosomen in ein Ultrazentrifugenrohr. Dann Pelletexosomen bei 100.000 x g für 80 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellet-Exosomen in 10 ml PBS wieder auf.
- Zentrifuge bei 100.000 x g für 80 min bei 4 °C, um das Exosomenpellet zu sammeln.
- Setzen Sie das Exosomenpellet in 200 l PBS wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
4. Charakterisierung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen
- Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration der Exosomenzubereitung durch Bicinchoninsäure-Assay (BCA)-Kit
- Pipette 10 l jedes Albumin-Standard- und isolierten Exosomen-Samples, die in Schritt 3.10 in eine 96-Well-Platte in doppelter Ausführung vorbereitet werden.
- Fügen Sie jedem Brunnen 200 L des Arbeitsreageims aus dem BCA-Kit hinzu. Mischen Sie den Inhalt der Platte gründlich auf dem Plattenschüttler für 10 s.
HINWEIS: Arbeitsreagenz (WR): 50-teiliges Reagenz A mit 1-teiligem Reagenz B. - Die Platten mit Folie bedecken und 30 min bei 37 °C bebrüten.
- Kühlen Sie die Platten auf Raumtemperatur (RT).
- Messen Sie die Probenaufnahme bei 562 nm über einen Plattenleser.
- Zubereitung und Färbung von Exosomen für die Durchflusszytometrie
- Erfassen Sie Exosomen, indem Sie 20 L antihumane CD63-Magnetperlen (4,5 m Größe)(Materialtabelle)in 25 g CB-SC-abgeleitete Exosomen aufnehmen, die in Schritt 3,10 insgesamt 100 l PBS-Volumen hergestellt werden.
- Inkubieren Sie das Rohr über Nacht (18-u201222 h) bei 4 °C auf dem Shaker bei 800 U/min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 30 s, um die Probe an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
- Fügen Sie 300 l Isolationspuffer (0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) hinzu und mischen Sie sanft durch Pipettieren.
HINWEIS: Dieser Schritt wärtigt die perlengebundenen Exosomen. - Legen Sie das Rohr auf einen Magnetständer für 1 min (Materialtabelle) und entsorgen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4-u20124.2.5.
- Setzen Sie die perlengebundenen Exosomen mit 400 L Isolationspuffer erneut aus.
- Aliquot 100 l Perlen gebundene Exosomen zu jedem Rohr.
- Fügen Sie fluoreszenzkonjugierte Antikörper (CD9-FITC, CD81-PE und CD63-FITC bei 25 g/ml) zu jedem Durchflussrohr mit CD63-Perlen-gefangenen Exosomen hinzu.
HINWEIS: Isotype-matched IgGs dienen als Negative-Kontrollen. - 45 min bei Raumtemperatur mit Lichtschutz am Shaker bei 800 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4-u20124.2.5.
- Setzen Sie die perlengebundenen Exosomen in 200 L Isolationspuffer wieder auf und übertragen Sie sie in 5 ml Durchflussrohre.
- Legen Sie die Rohre in das Probenkarussell des Durchflusszytometers.
- Öffnen Sie das Protokoll für Exosome-Tests.
- Führen Sie die Probe automatisch per Durchflusszytometer aus.
- Exosome-Erkennung durch Western Blot
HINWEIS: Western Blot ist eine etablierte Methode und wir werden nicht in Details der Methode selbst gehen.- Lyse die Pellets von CB-SC-abgeleiteten Exosomen aus Schritt 3.10 mit 100 l RIPA-Puffer, Pipette 20x, dann auf Eis für 5 min legen.
- Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration von Exosomenlysat per BCA-Kit und laden Sie 25 g Protein pro Brunnen.
- Trennen Sie die Proteine durch Gelelektrophorese für 40 min bei 150 V.
- Übertragen Sie das Protein auf die Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) mit dem halbtrockenen Übertragungsverfahren11.
- Blockieren Sie die Membran mit 5% fettfreier Milch für 30 min.
- Inkubieren Sie mit 2 g/ml antihumanem Alix (Materialtabelle) und 1 g/ml antihumanen Calnexin-Antikörpern (Materialtabelle).
- Erkennen Sie das Protein durch Chemilumineszenz mit einem digitalen Bildgebungssystem.
- Exosome-Validierung durch dynamische Lichtstreuung (DLS)
- Verdünnung von 10 g CB-SC-abgeleiteten Exosomenproben in 1 ml PBS.
- Übertragen Sie die 1 ml der verdünnten Probe in Einweg-Halbmikroküvette (Materialtabelle).
- Legen Sie die Küvette in das DLS-Instrument. Legen Sie den Brechungsindex (RI) für den gesamten Beispielmonitor auf 1,39 fest.
- Führen Sie Proben bei 25 °C aus und erfassen Sie drei Messungen pro Fraktion, um eine durchschnittliche Größenverteilung zu erhalten.
- Exosome-Validierung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
- Mantelformvar auf 300 Maschenkupfergitter12 (Tabelle der Materialien).
- Stärken Sie die Formvar mit der zusätzlichen Schicht aus verdampftem Kohlenstoff auf Kupfergittern12.
HINWEIS: Ein solcher Beschichtungsansatz eignet sich hervorragend für die Probenunterstützung. - 10 L Exosomenproben auf Gitter laden und lufttrocknen lassen.
- Negativ gefärbtProben mit Uranylacetat für 5 min.
- Dreimal mit DI-Wasser waschen und lufttrocknen lassen.
- Beobachten und fotografieren Sie die Proben unter TEM. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 200 kV und die Spotgröße auf 2 ein.
5. Messung von DIO-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen, die von verschiedenen Subpopulationen von PBMC aufgenommen wurden
-
Label CB-SC-abgeleitete Exosomen mit grünem fluoreszierendem lipophilem Farbstoff Dio
- Übertragen Sie 100 g CB-SC-abgeleitete Exosomen (in Schritt 3.10) in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
- Probe mit PBS auf 5 ml verdünnen.
- Fügen Sie grüne fluoreszierende lipophile Farbstoff Dio (Tabelle der Materialien) bis arbeitskonzentration erreicht 5 m.
- 15 min bei Lichtschutz inkubieren.
- Übertragen Sie die Probe in ein Ultrazentrifugenrohr.
- Zentrifuge bei 100.000 x g für 80 min zu Pellet Dio-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen.
- Setzen Sie die beschrifteten Exosomen in 200 l PBS wieder auf.
-
Vorbereitung der menschlichen PBMC
- 25 ml menschliches Buffy-Fell (Materialtabelle) über 20 ml Dichtegradientenmedium (γ = 1,077) in ein 50 ml konisches Rohr übertragen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.11.
- Übertragen Sie 1 x 106 PBMC in eine nicht gewebebehandelte hydrophobe 24-Well-Platte (1 ml/Well).
HINWEIS: Eine nicht gewebebehandelte Platte wurde verwendet, um das Anhaften von Monozyten zu vermeiden.
-
Co-Culture Dio-markierte Exosomen mit PBMC
- Übertragen Sie 40-L-Dio-markierte CB-SC-abgeleitete Exosomen, die in Schritt 5.1.7 hergestellt werden, auf jeden PBMC-haltigen Brunnen in einer 24-Well-Platte mit einer 200-L-Pipette. Fügen Sie das gleiche PBS-Volumen hinzu, um Bohrungen zu steuern.
- Mischen Sie durch Pipettierung 10x. Inkubieren für 4 h.
- Sammeln Sie 200 L exosomenbehandelte PBMC und Etikett mit Hoechst 33342 für 10 min bei Raumtemperatur.
- Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 100 l PBS wieder auf.
- Montieren Sie Zellen auf Mikroskopschlitten.
- Beobachten und fotografieren Sie die Wechselwirkung von DIO-markierten CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit Hoechst 33342-markierten PBMC mit einem Mikroskop.
- Übertragen Sie die verbleibenden Zellen von Schritt 5.3.3 in ein 1,5 ml Rohr.
- Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 200 L PBS wieder auf.
- Fügen Sie 5 L fc Blocker pro Probe hinzu. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie Antikörper (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 und CD56 bei 25 g/ml)(Materialtabelle)hinzu, um PBMC zu färben.
HINWEIS: Isotype-matched IgGs dienen als Negative-Kontrollen. - 30 min bei Raumtemperatur mit Lichtschutz bebrüten.
- 1 ml PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C hinzufügen, um die Zellen zu pellet.
- Setzen Sie die Zellen mit 200 L PBS wieder auf. Fügen Sie 5 L Propidiumjodid hinzu.
- Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um den Grad der Dio-markierten Exosomenaufnahme in verschiedenen Subpopulationen von PBMC zu bewerten.
6. Untersuchen Sie die Wirkung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen auf Monozyten
- Isolierung menschliche CD14-positive Monozyten
- Transfer 3 x 107 humane PBMC in ein 15 ml Rohr.
- Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
- Platzieren Sie die Trennsäule (Materialtabelle) in den Magnetabscheider (Materialtabelle).
- Waschen Sie Trennsäulen dreimal mit 2 ml Kaltlaufpuffer (Tabelle der Materialien).
- Setzen Sie die Zellen in 300 l kalten PBS wieder aus. Fügen Sie 60 L CD14 Mikroperlen hinzu. Gut mischen und 15 min auf Eis bebrüten.
- Fügen Sie 6 ml kalte PBS hinzu. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
- Setzen Sie die pelletierten Zellen in 500 L Kaltlaufpuffer wieder aus.
- Übertragen Sie Zellen in die Trennsäule (in Schritt 6.14) und lassen Sie sie passieren.
- Waschen Sie die Trennsäule dreimal mit 2 ml Laufpuffer pro Waschgang. Heben Sie die Säule aus dem Magnetabscheider und legen Sie sie in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
HINWEIS: Das 15 ml Rohr sollte aufgrund der Haftung von CD14-positiven Monozyten an der Röhre bei Raumtemperatur auf Eis gelegt werden. - Übertragen Sie 2 ml Kaltlaufpuffer an den oberen Rand der Säule und isolieren Sie die CD14-positiven Zellen in das 15 ml-Rohr.
- Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, um die CD14-positiven Zellen zu pellet.
- Die Zellen mit 2 ml kaltem chemisch-definierten Serum-freien Medium(Materialtabelle )wieder aufhängen
- Übertragen Sie 50 l Zellen in ein 1,5 ml-Rohr.
- Stain mit 10 'L Von Krome Orange-konjugierte Anti-Mensch CD14 mAb (Tisch der Materialien) für 20 min.
HINWEIS: Isotype-matched IgGs dienen als Negative-Kontrollen. - Fügen Sie den Zellen 1 ml PBS hinzu. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min zu Pelletzellen.
- Die Zellen in 200 l PBS wieder aufhängen und in ein 5 ml-Rohr übertragen. Bestimmen Sie die Reinheit von CD14-positiven Monozyten durch Durchflusszytometrie.
- Behandlung von Monozyten mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen
- Samen 1 x 106 gereinigte Monozyten mit chemisch-definiertem serumfreien Kulturmedium (Materialtabelle) in Gewebekultur-behandelter 6-Well-Platte (2 ml/Well).
- 2 h bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
- Entsorgen Sie den Überstand mit 1 ml Pipette. 2 ml 37 °C vorgewärmtes chemisch definiertes serumfreies Kulturmedium (Materialtabelle) schonend hinzufügen.
HINWEIS: Monozyten wurden innerhalb von 2 h an der Platte verklebten. Schwimmende Zellen wurden als tote oder andere Zellkontaminationen identifiziert. - Fügen Sie in einer 6-Well-Platte mit einem Gesamtvolumen von 2 ml 80 CB-SC-abgeleitete Exosomen, die von Schritt 3.10 isoliert sind, zu Monozytenkulturen hinzu.
HINWEIS: Das gleiche Volumen von PBS wurde hinzugefügt, um Brunnen zu steuern. - Inkubieren Bei 37 °C unter 5%CO2 für 3-u20124 Tage.
- Fotografieren Sie die Zellmorphologie mit einem invertierten Mikroskop bei 200× Vergrößerung (Materialtabelle).
- Trennen Sie Zellen, indem Sie in 1 ml eines PBS-basierten Zelldissoziationspuffers mit 1 ml Pipettenspitze nach oben und unten pfeifen.
- Ernten Sie die verbleibenden angeschlossenen Zellen über einen Zellschaber.
HINWEIS: Da primäre Monozyten oder differenzierte Makrophagen fest anhaften, bleiben einige Zellen nach der Behandlung mit Dissoziationspuffer am Boden haften. Daher werden diese Zellen mit einem Zellschaber geerntet. - Sammeln Sie Zellen bei 1.690 x g für 5 min. Wiederaussetzung von Zellen in 200 l PBS.
- Fügen Sie 5 l fc-Blocker (25 g/ml) hinzu, um die unspezifische Bindung zu blockieren.
- Fügen Sie Denzellen Antikörper (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 und CD209 mit 25 g/ml, Materialtabelle)hinzu. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Isotyp-matched IgGs dienen als negative Kontrolle - Fügen Sie 1 ml PBS zu Zellen und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn mit 200 L PBS erneut aus.
- Fügen Sie pro Probe 5 l Propidiumjodid (200 l) hinzu und übertragen Sie Zellen in ein neues 5 ml Durchflussrohr.
- Führen Sie die Durchflusszytometrie aus, und bewerten Sie die Ebenen von CD14-, CD80-, CD86-, CD163-, CD206- und CD209-Ausdrücken.
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Representative Results
Zunächst wurden der Phänotyp und die Reinheit von CB-SC durch Durchflusszytometrie mit CB-SC-assoziierten Markern wie Leukozyten-gemeinsames Antigen CD45, ES-zellspezifische Transkriptionsfaktoren OCT3/4 und SOX2 untersucht. CB-SC zeigt hohe Konzentrationen von CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 und Galectin 9-Expression an, jedoch keinen Ausdruck von CD34 (Abbildung 1A). Die Durchflusszytometrie-Analyse bestätigte die Expression von exosomenspezifischen Markern wie CD9, CD81 und CD63 auf CB-SC-abgeleiteten Exosomen (Abbildung 1B). Morphologie und Größenverteilung der Exosomen waren durch TEM und DLS gekennzeichnet (Abbildung 1C,D), mit einer Größe von 79,38 ± 20,07 nm. Western Blot bewies ferner die Expression des exosomenassoziierten Markers Alix, ohne Expression des ER-assoziierten Markers Calnexin (Abbildung 1E).
PBMC wurden mit Dio-labeled CB-SC-Exo behandelt. Die Mikroskopiebeobachtung zeigte die direkte Wechselwirkung von Dio-labeled CB-SC-Exo mit PBMC (Abbildung 2A). Um besser zu definieren, welche Zellpopulation mit dem Dio-labelierten CB-SC-Exo interagierte, wurden verschiedene Zellkompartimente mit zellspezifischen Markern wie CD3 für T-Zellen, CD11c für myeloische dendritische Zellen (DC), CD14 für Monozyten, CD19 für B-Zellen und CD56 für NK-Zellen(Abbildung 2B)abgegrenzt. Nach einer Inkubation für 4 Stunden zeigte die Durchflusszytometrie, dass verschiedene Blutkörperchen mit unterschiedlicher mittlerer Fluoreszenzintensität (MFI) von Dio-positiven Exosomen(Abbildung 2C)angezeigt wurden. Insbesondere zeigten Monozyten eine höhere mediane Fluoreszenzintensität von Dio-positivem CB-SC-Exo als die anderer Immunzellen (Abbildung 2C),was darauf hinweist, dass Monozyten in erster Linie von den CB-SC-abgeleiteten Exosomen ins Visier genommen wurden.
Um die direkten Auswirkungen von CB-SC-abgeleiteten Exosomen auf Monozyten zu untersuchen, wurden die gereinigten CD14+ Monozyten 3 Tage lang mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen kokultiviert. Die exosomenbehandelte Monozyten differenziert erfolgreich in spindelartige Morphologien (Abbildung 3A). Als nächstes wurden Phänotypen der mit CB-SC-Exo behandelten oder unbehandelten Monozyten getestet, die die Ausdrücke von M2-assoziierten Markern wie CD163, CD206, CD209 in der exosomenbehandelten Gruppe deutlich erhöhten(Abbildung 3B, rotes Histogramm). Im Vergleich zu den herkömmlichen M2-Makrophagen, die von M-CSF + IL-4 erzeugt wurden, exprimierte CB-SC-Exo-behandelte Monozyten ähnliche Konzentrationen von M2-assoziierten Markern wie CD163, CD206, CD209, ohne signifikante Unterschiede (Abbildung 3C). Daher deuten die Daten darauf hin, dass sich Monozyten nach der Behandlung mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen in Makrophagen mit M2-Phänotyp unterscheiden.
Abbildung 1: Charakterisierung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen. (A) Phänotypische Charakterisierung von CB-SC, hohe Expression von CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 und Galectin-9, kein Ausdruck von CD34. (B) Ausdrücke von Exosomen-assoziierten Markern (CD63, CD9, CD81) auf CB-SC-abgeleiteten Exosomen. Isotype-matched IgGs dienten als Steuerelemente für die Durchflusszytometrie (graues Histogramm). (C) Transmission Selektronenmikroskopie (TEM) Bild der CB-SC-abgeleiteten Exosomen. (D) Größenverteilung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit Dynamitic Light Scattering (DLS). (E) Westliche Flecken zeigen, dass CB-SC-abgeleitete Exosomen den exosomenspezifischen Marker Alix, aber negativ für endoplasmatisches Retikulum (ER)-assoziierten Marker Calnexin zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wechselwirkung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen mit verschiedenen PBMC-Populationen. (A) Die Wechselwirkung von CB-SC-Exo (grün) mit PBMC (blau, Die Kernfärbung mit Hoechst 33342) wurde mit dem Nikon Eclipse Ti2 Mikroskop mit der NIS-Elements Software Version 5.11.02 fotografiert, mit einer hohen Vergrößerung, die die Verteilung von Dio-markierten Exosomen (grün) in den PBMC-Zellen nach der Co-Inkubation für 4 h 5%CO2 in der nicht-gewebekulturbehandelten 24-Well-Platte zeigt. n = 2. (B) Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse mit zellspezifischen Oberflächenmarkern für verschiedene Subpopulationen in PBMC, einschließlich CD3 für T-Zellen, CD14 für Monozyten, CD19 für B-Zellen, CD56 für NK-Zellen und CD11c für DCs. (C) Zeigen Sie unterschiedliche mediane Fluoreszenzintensität (MFI) von Dio-markiertem Exosom zwischen verschiedenen PBMC-Subpopulationen (z. B. T-Zellen, Monozyten, B-Zellen, NK-Zellen, DCs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswirkungen von CB-SC-abgeleiteten Exosomen auf Monozyten. (A) Morphologische Veränderung von Monozyten in die spindelähnlichen Zellen nach Behandlung mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen. (B) Die Expression von M2-assoziierten Markern nach der Behandlung mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen wie CD163, CD206 und CD209 (rote Linie) regulierte. Unbehandelte Monozyten (grüne Linie) dienten als Kontrolle. Isotype-matched IgGs dienten als Negativkontrollen (graue Linie). (C) Phänotischer Vergleich zwischen konventionellen M2-Makrophagen und den CB-SC-Exo-induzierten M2-Makrophagen. Zur Erzeugung der herkömmlichen M2-Makrophagen wurden die gereinigten CD14+ Monozyten mit 50 ng/ml Makrophagenkolonien-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 37 °C, 5%CO2-Bedingungen für 7 Tage und anschließend mit der Nachtbehandlung mit 10 ng/ml IL-4 behandelt. M2-assoziierte Marker einschließlich CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 und CD209 wurden mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Isotyp-matched Immunglobulin G (IgG) dienen als Kontrolle. Die Daten werden als mittlerer ± SD dargestellt; N = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Anwendung von Exosomen ist ein aufstrebendes Feld für klinische Diagnostik, Arzneimittelentwicklungen und regenerative Medizin. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen und zur funktionellen Untersuchung von Exosomen zur Differenzierung menschlicher Monozyten vor. Das aktuelle Protokoll zeigte, dass funktionelle CB-SC-abgeleitete Exosomen durch sequentielle Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit hoher Reinheit isoliert werden und die Immunmodulation auf Monozyten aufweisen.
Im Vergleich zu anderen konventionellen Protokollen ist Ultrafiltration ein etablierter Ansatz zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus verschiedenen Zellen oder Medien, basierend auf dem Molekulargewicht und den Ausschlussgrößen, die sich von anderen extrazellulären Vesikeln (EVs) unterscheiden. Während die Ultrafiltrationsisolierung zeitsparender ist als die auf Ultrazentrifugierung basierende Trennung, kann sie bei großen Größen strukturelle Schäden an Vesikelverursachen verursachen. Exosomen können auch durch Polyethylenglykol (PEG)-vermittelte Fällung zu niedrigen Kosten gesammelt werden, obwohl diese Methode die Exosomenreinheit aufgrund der Proteinkontaminationen13,14gefährdet. Daher war das aktuelle Protokoll kostengünstig, um Exosomen mit hoher Reinheit zu produzieren. Basierend auf den Immunmodulationen von CB-SC-abgeleiteten Exosomen10kann die Charakterisierung von CB-SC-abgeleiteten Exosomen einen wertvollen Biomarker bieten, um die Wirksamkeit von Stammzellpädagogen mit CB-SC vor klinischen Anwendungen zu bewerten.
Makrophagen sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen gegen virale und bakterielle Infektionen mit unterschiedlichen biologischen Funktionen und Heterogenitäten. Basierend auf ihren Unterschieden in Oberflächenmarkern und Immunfunktion werden Makrophagen mit zwei Subpopulationen kategorisiert: Typ 1 Makrophagen (M1, konventionelle Makrophagen, die Entzündungen verursachen) und Typ 2 Makrophagen (M2, Anzeige anti-inflammation)15. Diese Studie stellte fest, dass gereinigte menschliche Monozyten nach der Behandlung mit CB-SC-abgeleiteten Exosomen in Typ-2-Makrophagen unterschieden wurden, was einen anti-inflammationlichen Phänotyp10zeigte. CB-SC-abgeleitete exosome-behandelte Monozyten zeigten die längliche Morphologie und drückten die M2-assoziierten Oberflächenmarker (z. B. CD163, CD206 und CD209) mit dem ähnlichen Phänotyp wie die herkömmlichen M2-Makrophagen aus, die mit Zytokinen M-CSF + IL-4 erzeugt wurden. Solche phänotypischen Veränderungen von Monozyten unterstreichen den neuen Mechanismus, der der Immunmodulation von CB-SC zur Behandlung von Typ-1-Diabetes und anderen Autoimmunerkrankungen zugrunde liegt. Während der SCE-Therapie wurden die Immunzellen der Patienten für ca. 8-u20129 h mit CB-SC kokultiviert. Die SCE-behandelten Monozyten trugen die CB-SC-abgeleiteten Exosomen zurück in den Körper, was zur M2-Differenzierung und zur Ausweitung der Induktion der Immuntoleranz beitrug, was zur Verbesserung der klinischen Ergebnisse nach der Behandlung mit SCE-Therapie führte.
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Disclosures
Dr. Zhao ist Gründer von Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr. Zhao ist ein Erfinder der Stem Cell Educator Technologie. Alle anderen Autoren haben keine finanziellen Interessen, die für das eingereichte Werk relevant sein könnten.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Poddar und Herrn Ludwig für die großzügige Finanzielle Unterstützung über die Hackensack UMC Foundation. Wir schätzen Laura Zhao für die englische Bearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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