Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados
Summary
A aplicação de exosomo é uma ferramenta emergente para o desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Estabelecemos um protocolo de isolamento exossomo com alta pureza para isolar exosóis de células-tronco identificadas chamadas CB-SC para estudos mecanicistas. Também cocultura cb-SC-derivado exosósmos com monócitos humanos, levando à sua diferenciação em macrófagos fenotipicamente distintos.
Abstract
A terapia com células-tronco (SCE) é uma nova abordagem clínica para o tratamento de diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes. A terapia de CIP circula as células mononucleares sanguíneas isoladas do paciente (por exemplo, linfócitos e monócitos) através de uma máquina de aferese, co-culturas as células mononucleares sanguíneas do paciente com células-tronco derivadas do sangue do cordão aderente (CB-SC) no dispositivo SCE e, em seguida, devolve essas células imunes “educadas” ao sangue do paciente. Exosóis são vesículas extracelulares de tamanho nano-tamanho entre 30\u2012150 nm existentes em todos os meios de cultura biofluida e celular. Para explorar ainda mais os mecanismos moleculares subjacentes à terapia SCE e determinar as ações de exosóis liberados do CB-SC, investigamos quais células fagocitizam esses exosóis durante o tratamento com CB-SC. Ao co-culturar exosóis derivados do CB-SC com células mononucleares de sangue periféricos (PBMC), descobrimos que exosóis derivados do CB-SC foram predominantemente tomados por monócitos humanos CD14-positivos, levando à diferenciação de monócitos em macrófagos tipo 2 (M2), com morfologia semelhante ao fuso e expressão de marcadores moleculares de superfície associados a M2. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de exosóis derivados do CB-SC e o protocolo para a co-cultura de exosóis derivados do CB-SC com monócitos humanos e o monitoramento da diferenciação M2.
Introduction
As células-tronco do sangue do cordão umbilical (CB-SC) são um tipo único de células-tronco identificadas do sangue do cordão humano e distinguem-se de outros tipos conhecidos de células-tronco, como células-tronco mesenquimais (MSC) e células-tronco hematopoiéticas (HSC)1. Com base em suas propriedades únicas de modulação imunológica e sua capacidade de aderir firmemente à superfície das placas de Petri, desenvolvemos uma nova tecnologia designada como terapia de Educador de Células-Tronco (SCE) em ensaios clínicos2,3. Durante a terapia de SCE, as células mononucleares de sangue periféricos (PBMC) são coletadas e circuladas através de um separador celular e co-cultivadas com cb-SC aderente in vitro. Essas células “educadas” (PBMC tratada pelo CB-SC) são então devolvidas à circulação do paciente em um sistema de loop fechado. Os ensaios clínicos já demonstraram a segurança clínica e a eficácia da terapia de ED para o tratamento de doenças autoimunes, incluindo diabetes tipo 1 (T1D)2,4 e alopecia areata (AA)5.
Exosóis são uma família de nanopartículas com diâmetros que variam de 30\u2012150 nm e existem em todos os meios biofluidos e de cultura celular6. Exosóis são enriquecidos com muitas moléculas bioativas, incluindo lipídios, mRNAs, proteínas e microRNAs (miRNA), e desempenham um papel importante nas comunicações célula-célula. Ultimamente, os exósmos tornaram-se mais atraentes para pesquisadores e empresas farmacêuticas devido aos seus potenciais terapêuticos nas clínicas7,8,9. Recentemente, nossos estudos mecanicistas demonstraram que exosóis liberados pelo CB-SC contribuem para a modulação imunológica da terapia SCE10.
Aqui, descrevemos o protocolo para explorar o mecanismo da terapia SCE visando monócitos por exosóis liberados pela CB-SC. Primeiro, os exosóis liberados pelo CB-SC foram isolados da mídia condicionada pelo CB-SC usando métodos de ultracentrifugação e validados por citometria de fluxo, mancha ocidental (WB) e dispersão dinâmica de luz (DLS). Em segundo lugar, os exosóis derivados do CB-SC foram rotulados com um corante lipofílico fluorescente verde: Dio. Em terceiro lugar, foram co-cultivados com o PBMC para examinar os percentuais positivos de exosóis derivados do CB-SC rotulados por Dio nas diferentes subpopulações do PBMC por citometria de fluxo. Este protocolo fornece orientação para estudar a ação de exosóis subjacentes à modulação imunológica das células-tronco.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aplicação de exosóis é um campo emergente para diagnóstico clínico, desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre a preparação de exosóis derivados do CB-SC e o estudo funcional de exosóis sobre a diferenciação de monócitos humanos. O protocolo atual demonstrou que os exosóis funcionais derivados do CB-SC são isolados por centrifugação sequencial e ultracentrifugação com alta pureza e exibindo a modulação imunológica em monócitos.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao Sr. Poddar e ao Sr. Ludwig pelo generoso apoio de financiamento através da Fundação Hackensack UMC. Agradecemos laura Zhao pela edição em inglês.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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