ヒト臍帯血幹細胞(CB-SC)由来エキソソームによる治療後の単球の異定異性マクロファージへの分化
Summary
エキソソームアプリケーションは、医薬品開発と再生医療のための新たなツールです。我々は、高純度のエキソソーム分離プロトコルを確立し、機械学的研究のためにCB-SCと呼ばれる新しい同定された幹細胞からエキソソームを分離する。また、CB-SC由来エキソソームをヒト単球と共培養し、その分化を、定型的に区別するマクロファージに導いた。
Abstract
幹細胞教育者(SCE)療法は、1型糖尿病および他の自己免疫疾患の治療のための新しい臨床アプローチである。SCE療法は、単離された患者の血液単核細胞(例えば、リンパ球および単球)をアフェレシス機を介して循環し、SCE装置中の接着性臍帯血由来幹細胞(CB-SC)を有する患者の血液単核細胞を共培養し、これらの「教育された」免疫細胞を患者の血液に戻す。エキソソームは、すべての生体流体および細胞培養媒体に存在する30\u2012150 nmの間のナノサイズの細胞外小胞である。SCE療法の基礎となる分子メカニズムをさらに探求し、CB-SCから放出されるエキソソームの作用を調べるため、CB-SCによる治療中にこれらのエキソソームを食作用させる細胞を調べる。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)と共に標識されたCB-SC由来エキソソームを共培養することにより、CB-SC由来エキソソームはヒトCD14陽性単球によって主に取り込まれ、スピンドル様形態とM2関連表面マーカーの発現を伴う単球の分化(M2)につながることがわかった。ここでは、CB-SC由来エキソソームの分離と特徴付けのためのプロトコルと、ヒト単球とCB-SC由来エキソソームの共培養とM2分化のモニタリングのためのプロトコルを提示する。
Introduction
臍帯血幹細胞(CB-SC)は、ヒト臍帯血から同定された独自のタイプの幹細胞であり、間葉系幹細胞(MSC)および造血幹細胞(HSC)1などの他の既知のタイプの幹細胞と区別される。免疫変調の特性とペトリ皿の表面にしっかりと付着する能力に基づいて、我々は臨床試験2、3で幹細胞教育者(SCE)療法として指定された新しい技術を開発しました。SCE療法の間に、患者の末梢血単核細胞(PBMC)は細胞分離器を介して集め、循環し、インビトロの付着CB-SCと共培養される。これらの「教育された」細胞(CB-SC処理PBMC)は、閉ループシステムで患者の循環に戻されます。臨床試験は、1型糖尿病(T1D)2、4および脱毛症(AA)5を含む自己免疫疾患の治療に対するSCE療法の臨床的安全性および有効性を既に実証している。
エキソソームは、直径30\u2012150 nmのナノ粒子ファミリーであり、すべての生体流体および細胞培養培地6に存在する。エキソソームは、脂質、mRNA、タンパク質、マイクロRNA(miRNA)を含む多くの生理活性分子で富化され、細胞間通信において重要な役割を果たします。最近では、エキソソームは、診療所7、8、9の治療の可能性のために、研究者や製薬会社にとってより魅力的になっています。最近、我々の機械学的研究はCB-SC放出エキソソームがSCE療法10の免疫調節に寄与することを実証した。
ここでは、CB-SC放出エキソソームによる単球を標的とするSCE療法のメカニズムを探るプロトコルについて述べる。まず、CB-SC放出エキソソームを超遠心分離法を用いてCB-SC由来のコンディション培地から分離し、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット(WB)および動的光散乱(DLS)によって検証した。第2に、CB-SC由来エキソソームは、緑色蛍光性親油性色素であるディオで標識した。第三に、彼らは、フローサイトメトリーによるPBMCの異なる亜集団におけるディオ標識CB-SC由来エキソソームの正の割合を調べるためにPBMCと共培養した。このプロトコルは、幹細胞の免疫調節の基礎となるエキソソームの作用を研究するためのガイダンスを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
エキソソームの応用は、臨床診断、医薬品開発、再生医療の新たな分野です。ここでは、CB-SC由来エキソソームの調製とヒト単球の分化に関するエキソソームの機能研究に関する詳細なプロトコルを提示する。現在のプロトコルは、機能的CB-SC由来エキソソームが高純度で逐次遠心分離と超遠心分離によって単球に免疫変調を示すことによって単一体化されることを実証した。
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ハッケンサックUMC財団を通じて寛大な資金援助をしてくれたポダー氏とルートヴィヒ氏に感謝しています。私たちは、英語の編集のためにローラ・ジャオに感謝します。
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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