Summary

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

Published: February 09, 2021
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Summary

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine aufstrebende krebstherapeutische Strategie, die ein Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (IR700Dye) und NIR-Licht verwendet, um Krebszellen zu zerstören. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Antitumorwirkung von NIR-PIT in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs und malignes Pleuramesotheliom mittels Biolumineszenzbildgebung zu bewerten.

Abstract

Die Wirksamkeit der Photoimmuntherapie kann mit einem orthotopen Mausmodell genauer beurteilt werden als mit einem subkutanen. Ein Pleuraverbreitungsmodell kann zur Bewertung von Behandlungsmethoden für intrathorakische Erkrankungen wie Lungenkrebs oder malignes Pleuramesotheliom verwendet werden.

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine kürzlich entwickelte Krebsbehandlungsstrategie, die die Spezifität von tumoranvisierenden Antikörpern mit der Toxizität kombiniert, die durch einen Photoabsorber (IR700Dye) nach Exposition gegenüber NIR-Licht verursacht wird. Die Wirksamkeit von NIR-PIT wurde unter Verwendung verschiedener Antikörper berichtet; die therapeutische Wirkung dieser Strategie wurde jedoch nur in wenigen Berichten in einem orthotopischen Modell gezeigt. In der vorliegenden Studie zeigen wir ein Beispiel für die Wirksamkeitsbewertung des pleural disseminierten Lungenkrebsmodells, das mit NIR-PIT behandelt wurde.

Introduction

Krebs bleibt trotz jahrzehntelanger Forschung eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit. Ein Grund dafür ist, dass Strahlentherapie und Chemotherapie hochinvasive Techniken sind, die ihren therapeutischen Nutzen einschränken können. Zell- oder molekular-zielgerichtete Therapien, bei denen es sich um weniger invasive Techniken handelt, erhalten erhöhte Aufmerksamkeit. Die Photoimmuntherapie ist eine Behandlungsmethode, die die therapeutische Wirkung durch die Kombination von Immuntherapie und Phototherapie synergistisch verstärkt. Die Immuntherapie verbessert die Tumorimmunität, indem sie die Immunogenität der Tumormikroumgebung erhöht und die immunregulatorische Unterdrückung reduziert, was zur Zerstörung von Tumoren im Körper führt. Die Phototherapie zerstört Primärtumoren mit einer Kombination aus Photosensibilisatoren und Lichtstrahlen, und tumorspezifische Antigene, die aus den Tumorzellen freigesetzt werden, verbessern die Tumorimmunität. Tumore können selektiv mit Photosensibilisatoren behandelt werden, da sie spezifisch und selektiv für die Zielzellen sind. Die Modalität der Phototherapie umfasst photodynamische Therapie (PDT), photothermische Therapie (PTT) und photochemische Therapien1.

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine kürzlich entwickelte Methode der Antitumor-Phototherapie, die photochemisch basierte Therapie und Immuntherapiekombiniert 1,2. NIR-PIT ist eine molekular zielgerichtete Therapie, die auf spezifische Zelloberflächenmoleküle durch die Konjugation eines Nahinfrarot-Siliziumphthalocyaninfarbstoffs, IRdye 700DX (IR700), zu einem monoklonalen Antikörper (mAb) abzielt. Die Zellmembran der Zielzelle wird bei Bestrahlung mit NIR-Licht (690 nm)zerstört 3.

Das Konzept der gezielten Lichttherapie durch Kombination herkömmlicher Photosensibilisatoren und Antikörper oder gezielter PDT ist über drei Jahrzehnte alt4,5. Frühere Studien haben versucht, konventionelle PDT-Wirkstoffe anzusprechen, indem sie mit Antikörpern konjugiert wurden. Der Erfolg war jedoch begrenzt, da diese Konjugate aufgrund der Hydrophobie der Photosensibilisatoren in der Leber eingeschlossen waren6,7. Darüber hinaus unterscheidet sich der Mechanismus von NIR-PIT völlig von dem der herkömmlichen PDT. Herkömmliche Photosensibilisatoren erzeugen oxidativen Stress, der aus einer Energieumwandlung resultiert, die Lichtenergie absorbiert, in einen angeregten Zustand verrenkt, in den Grundzustand übergeht und Apoptose verursacht. NIR-PIT verursacht jedoch eine schnelle Nekrose, indem es die Zellmembran direkt zerstört, indem Es Photosensibilisatoren auf der Membran durch eine photochemische Reaktion aggregiert8. NIR-PIT ist der herkömmlichen zielgerichteten PDT in vielerlei Hinsicht überlegen. Herkömmliche Photosensibilisatoren haben niedrige Extinktionskoeffizienten, die die Bindung einer großen Anzahl von Photosensibilisatoren an ein einzelnes Antikörpermolekül erfordern, was möglicherweise die Bindungsaffinität verringert. Die meisten herkömmlichen Photosensibilisatoren sind hydrophob, was es schwierig macht, die Photosensibilisatoren an Antikörper zu binden, ohne ihre Immunreaktivität oder In-vivo-Zielakkumulation zu beeinträchtigen. Herkömmliche Photosensibilisatoren absorbieren typischerweise Licht im sichtbaren Bereich und reduzieren die Gewebepenetration.

Mehrere Studien zu NIR-PIT, die auf intrathorakische Tumoren wie Lungenkrebs und maligne Pleuramesotheliomzellen (MPM) abzielen, wurden berichtet9,10,11,12,13,14,15,16,17. Allerdings haben nur wenige Berichte die Wirksamkeit von NIR-PIT in pleural disseminierten MPM- oder Lungenkrebsmodellen9,10,11,12beschrieben. Subkutane Tumor-Xenograft-Modelle gelten als Standard-Tumormodelle und werden derzeit häufig verwendet, um die Antitumoreffekte neuer Therapien zu bewerten18. Die mikroumgebung des subkutanen Tumors ist jedoch nicht freizügig für die Entwicklung einer geeigneten Gewebestruktur oder eines Zustands, der einen echten malignen Phänotyp19, 20,21,22richtig rekapituliert . Idealerweise sollten orthotopische Krankheitsmodelle für eine genauere Beurteilung der Antitumorwirkungen erstellt werden.

Hier demonstrieren wir eine Methode zur Wirksamkeitsbewertung in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs, das mit NIR-PIT behandelt wurde. Ein Pleuraverbreitungsmausbau-Mausmodell wird durch Injektion von Tumorzellen in die Brusthöhle generiert und mittels Luciferase-Lumineszenz bestätigt. Die Maus wurde mit einer intravenösen Injektion von mAb behandelt, konjugiert mit IR700 und NIR-Bestrahlung in die Brust. Die therapeutische Wirkung wurde mittels Luciferase-Lumineszenz evaluiert.

Protocol

Alle In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortierressourcen des Nagoya University Animal Care and Use Committee durchgeführt (Genehmigung #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Sechs Wochen alte homozygote athymische Nacktmäuse wurden im Animal Center der Nagoya University gekauft und gepflegt. Bei der Durchführung des Verfahrens an Mäusen wurden sie mit Isofluran betäubt (Einführung: 4-5%, Erhaltung 2-3%); die Pfote wurde mit e…

Representative Results

Der Anti-Podoplanin-Antikörper NZ-1 wurde mit IR700 konjugiert, um NZ-1-IR700 zu erzeugen. Wir haben die Bindung von NZ-1 und IR700 auf einer SDS-PAGE bestätigt (Abbildung 8). Luciferase-exprimierendes H2373 (H2373-luc) wurde hergestellt, indem maligne Mesotheliomzellen (H2373) mit einem Luciferase-Gen10transfiziert wurden. Wir betäubten 8-12 Wochen alte weibliche homozygote athymische Nacktmäuse und injizierten 1 × 105 H237…

Discussion

In dieser Studie demonstrierten wir eine Methode zur Messung der therapeutischen Wirkung von NIR-PIT auf das Pleuraverbreitungsmodell von MPM. Hochselektive Zelltötung wurde mit NIR-PIT durchgeführt; so wurde das normale Gewebe kaum geschädigt23,24,25. Bei dieser Art der selektiven Zelltötung erwies sich NIR-PIT in disseminierten Modellen9,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nichts

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red Wako 209-016941 for cell culture
1mL syringe TERUMO SS-01T for mice experiment
30G needle Nipro 1907613 for mice experiment
BALB/cSlc-nu/nu Japan SLC
Collidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025 use for gel protein staining
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200 for measuring the APC concentration
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Wako 043-07216 use for conjugation of IR700
D-Luciferin (potassium salt) Cayman Chemical 14681 for bioluminescence imaging and DLIT
GraphPad Prism7 GraphPad software for statistical analysis
Image Studio Li-Cor Biosciences for analyzing 700 nm fluorescent image
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
isoflurane Wako 095-06573 for mice anesthesia
IVIS Spectrum CT PerkinElmer for capturing bioluminescent image and DLIT
Living Image PerkinElmer for analyzing bioluminescent image and DLIT
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763 use for conjugation of IR700
NIR Laser Changchun New Industries Optoelectronics Technology MRL-III-690R for NIR irradiation
Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well Invitrogen XP04202BOX use for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) Invitrogen NP0007 use for SDS-PAGE
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100 for measuring the output of the NIR laser 
PBS(-) Wako 166-23555
Pearl Trilogy imaging system Li-Cor Biosciences for capturing 700 nm fluorecent image
Penicilin-Streptomycin Solution (x100) Wako 168-23191 for cell culture
Puromycin Dihydrochloride ThermoFisher A1113803 for luciferase transfection
RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles PerkinElmer CLS960002 for luciferase transfection
RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red Wako 189-02025 for cell culture
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01 use for conjugation of IR700
UV-1900i Shimadzu for measuring the APC concentration

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Cite This Article
Yasui, H., Nishinaga, Y., Taki, S., Takahashi, K., Isobe, Y., Sato, K. Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination. J. Vis. Exp. (168), e61593, doi:10.3791/61593 (2021).

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